基于网络药理学和分子对接预测大黄素治疗脑缺血中风的作用机制
贾彩霞 陈建新 庞小涵 高阔 李京忠 张飞龙 王金平 王伟 徐晓新 赵慧辉
摘要 目的：利用网络药理学和分子对接的方法，预测大黄素治疗脑缺血中风的作用机制。方法：使用SymMap、TCMSP、OMIM、Drugbank数据库获得大黄素治疗脑缺血中风靶点，并通过Uniprot数据库进行格式统一及非人源靶点的去除。然后利用AlzData数据库进行大黄素治疗脑缺血中风的靶点在大脑细胞中的分布表达情况分析，使用DAVID数据库对其进行KEGG通路分析和GO分析，得到相关通路。结果：大黄素治疗脑缺血中风的潜在作用靶点共10个，分别为CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9、PRKCE、PTGS2、MYC、TP53，各自在大脑星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞等中有不同程度的表达，涉及KEGG相关富集通路12条、GO生物过程富集条目14条、GO细胞组分富集条目3条、GO细胞功能富集条目2条。分子对接结果发现与CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9结合较好。结论：大黄素可能主要通过CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9作用于细胞凋亡通路及炎症反应相关等通路来发挥治疗脑缺血中风的作用。
关键词 网络药理学;分子对接;脑缺血中风;大黄素;靶点;通路;机制
Mechanism Research of Emodin in the Treatment of Ischemic Stroke Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
JIA Caixia1，CHEN Jianxin1，PANG Xiaohan1，GAO Kuo2，LI Jingzhong1，ZHANG Feilong1，WANG Jinping3，WANG Wei1，XU Xiaoxin1，ZHAO Huihui1
（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 3 China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）
Abstract Objective：To research the mechanism of emodin in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology and molecular docking.Methods：Emodin targets for ischemic stroke were obtained by using SymMap，TCMSP，OMIM and Drugbank databases，and the format was unified and non-human targets were removed by Uniprot database.Then AlzData database was used to analyze the distribution and expression of emodin targets in brain cells for cerebral ischemia stroke.KEGG pathway and GO enrichment analysis was performed on the target of emodin for ischemic stroke using DAVID database to obtain the relevant pathway.Results：There were 10 potential targets for emodin in the treatment of ischemic stroke，which were CASP3，KDR，PTGS1，TNF，MMP9，PRKCE，PTGS2，MYC，TP53.They were expressed in astrocytes，microglia and endothelial cells in a different degrees.There were 12 KEGG related enrichment pathways，14 GO biological process enrichment items，3 GO cell component enrichment items，and 2 GO cell functional enrichment items related to ischemic stroke，and it had a good combination with CASP3，KDR，PTGS1，TNF and MMP9.Conclusion：Emodin may play a role in the treatment of ischemic stroke mainly through CASP3，KDR，PTGS1，TNF，MMP9 acting on apoptosis pathways and inflammation-related pathways.
Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Ischemic stroke; Emodin; Target; Pathway; Mechanism
中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.005
中风是世界范围内造成残疾甚至死亡很大比例的一种脑血管疾病[1]，分为缺血性中风和出血性中风，其中85%的中风是缺血性的[2]。缺血性脑中风是常见的脑血管病，是由脑血管狭窄或闭塞引起的，具有高并发率和高死亡率的特点[3]。在中医学中被认为是“中风”，李东垣曰：“中风为百病之长，乃气血闭而不行”[4]。因此，活血调气成为治疗中风的重要治则。《神农本草经》中记载大黄，性味苦寒，具有泻下通便、活血化瘀等功能，目前研究表明其含有的有效化合物有蒽醌类（如游离型蒽醌大黄素，结合型蒽醌大黄素甲醚葡萄糖苷）、多糖、鞣质等[5]。大黄素作为发挥药理学作用的一个重要成分，在缺血性脑卒的治疗中起到了至关重要的作用，有相关报道称其可以抗氧化、抑制胶质细胞活化从而发挥神经保护作用[6]，能够改善缺血性中风大鼠的神经功能[7]。网络药理学综合了多种学科的理论基础，能够将药物、药物的化学成分、靶点等之间的联系展示出来，SymMap数据库包含了中药、成分、靶点、疾病、中医症状、西医症状6个部分，可通过其来搜索大黄素的靶点。反向分子对接技术可以将小分子药物与大分子靶标的潜在结合口袋进行对接，根据结合的紧密程度筛选小分子药物的靶点，我们从网络药理学的角度对大黄素治疗缺血性中风的作用机制进行研究，并利用反向分子对接技术对其作用靶点进行模拟筛选，旨在为进一步阐述大黄素在缺血性中风方面的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 大黄素结构及其对应靶点的获得 在Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中以大黄素的CAS号（518-82-1）为关键词进行搜索，查找大黄素的SDF结构，并下载保存。利用SymMap数据库（https：//www.symmap.org/）和TCMSP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索大黄素的靶点，并去除重复的靶点，最终得到大黄素的潜在作用靶点。
1.2 脑缺血中风靶点的获得 使用Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）数据库（https：//omim.org/）、Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca/）进行脑缺血中风靶点的搜索，将搜索得到的靶点在uniprot数据库（https：//ebi12.uniprot.org/）中进行名称和编号的格式统一，删除重复，然后排除非人源靶点，获得疾病靶点，以便进行下一步的分析。将大黄素潜在作用靶点与脑缺血性中风靶点进行映射，最终获得大黄素治疗脑缺血性中风的靶点。
1.3 大黄素治疗脑缺血性中风的靶点在大脑细胞中的分布表达情况 利用AlzData数据库[8-9]（http：//www.alzdata.org/index.html）将上述得到的大黄素治疗脑缺血性中风的相关靶点进行其在大脑不同类型细胞中（主要观察的细胞为：内皮细胞（Endothelial）、星形胶质细胞（Astrocytes）、小胶质细胞（Microglia）、少突细胞（Oligodendrocytes）、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、神经元（Neurous）的分布表达情况分析。具体方法为：打开AlzData数据库之后选择Single Cell Expression，点击进入查询界面，然后将上述得到的大黄素治疗脑缺血性中风的相关靶点输入，点击Submit，随后对其结果进行基因单细胞表达情况分析。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 String数据库（https：//string-db.org/）是一个在线搜索的蛋白质-蛋白质相互作用关系数据库，能够对单个蛋白质进行检索，得到此蛋白质-蛋白质相互作用的所有蛋白构成的网络，也可以对输入的多个蛋白间的相互作用网络进行挖掘。通过Sting数据库分析大黄素治疗脑缺血中风的潜在作用靶点蛋白之间的相互作用关系网络图，并使用Cytoscape_v3.2.1软件进行结果的可视化，用Network Analyzer插件进行网络特征的分析。
1.5 KEGG通路分析和GO分析 DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个生物信息学数据库[10]，其包含生物学数据及相应分析工具，其中在Functional Annotation工具下包含3个子工具：第1个子工具为Functional Annotation Clustering，这部分主要是对注释上的条目做聚类，分数越高，表示该组内的基因在列表中越重要;第2个子工具为Functional Annotation Chart，这部分主要提供GO注释、KEGG注释、蛋白质-蛋白质相互作用等;第3个子工具为Functional Annotation Table，主要是对基因的功能注释，以表格的形成展示。因此我们使用DAVID数据库Functional Annotation工具对大黄素治疗脑缺血性中风的靶点进行KEGG通路分析和GO分析，并利用Cytoscape_v3.2.1软件构建通路与之相关的靶点网络。
1.6 分子对接 根据大黄素治疗脑缺血性中风的蛋白名称在PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）中进行下载蛋白的晶体结构，然后利用Uniprot數据库中记载的Structure相应链信息，保留相应的链，进行去水、去除多余链、加氢等操作之后生成活性口袋，做好蛋白预处理，并将下载好的大黄素结构利用Sybyl软件进行能量最小化处理，具体操作为点击Applications，选择Ligand Preparation选项，点击set up之后选择Generate One preferred 3D Structure选项[11]。随后采用Sybyl2.0的Surflex-Dock功能将准备好的蛋白与小分子进行分子对接，并将完成后的结果导入到Excel表格中，通过对接会得到几种得分：Total Score、Crash、Polar、D_SCORE、PMF_SCORE、G_SCORE、CHEMSCORE、CSCORE、GLOBAL_CSCORE，本次实验采用的是CSCORE得分来评价大黄素与活性靶点的关系。
2 结果
2.1 大黄素结构的获得 应用Pubchem数据库得到的大黄素SDF结构。见图1。利用SymMap数据库和TCMSP数据库搜索得到大黄素的潜在作用靶点，共得到34个。见图2A。
2.2 脑缺血性中风靶点的获得 经过OMIM和Drugbank数据库的检索及格式统一，去除重复，去除非人源靶点之后，共得到脑缺血性中风靶点共176个，其中来源于OMIM数据库中的有121个，来源于Drugbank数据库中的有55个。将大黄素潜在作用靶点与脑缺血性中风靶点进行映射，最终获得大黄素治疗脑脑缺血中风靶点10个（ACTA2、CASP3、KDR、MMP9、MYC、PRKCE、PTGS1、PTGS2、TNF、TP53），随后将大黄素的靶点与脑缺血中风的相关靶点运用在线工具Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行韦恩图的绘制。见图2B。
2.3 大黄素治疗脑缺血性中风的靶点在大脑细胞中的分布表达情况 利用AlzData数据库将大黄素治疗脑缺血性中风的靶点进行其在大脑不同类型细胞中的分布表达情况分析，结果发现：ACTA2在这些细胞中表达程度不是很高，几乎不表达，CASP3主要在星形胶质细胞（Astrocytes）、少突细胞（Oligodendrocytes）、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、神经元（Neurous）中表达，KDR主要在内皮细胞（Endothelial）中表达，MMP9在这些细胞中表达程度不是很高，几乎不表达，MYC主要在内皮细胞（Endothelial）、小胶质细胞（Microglia）中表达，PRKCE主要在神经元（Neurous）中表达，PTGS1主要在小胶质细胞（Microglia）中表达，PTGS2主要在小胶质细胞（Microglia）中表达，TNF在这些细胞中表达程度不是很高，几乎不表达，TP53主要在内皮细胞（Endothelial）、星形胶质细胞（Astrocytes）、小胶质细胞（Microglia）、少突细胞（Oligodendrocytes）中表达。见图3A、3B、3C、3D。
2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 将上述得到的大黄素治疗脑脑缺血中风的潜在作用靶点导入String数据库中，得到蛋白质-蛋白质相互作用网络图。见图4。然后将相互作用结果通过Cytoscape软件进行结果的可视化，用Network Analyzer插件进行网络特征的分析，Degree值按照从大到小的顺序依次为TNF（Degree=8）、CASP3（Degree=7）、TP53（Degree=7）、PTGS2（Degree=7）、KDR（Degree=6）、MMP9（Degree=6）、MYC（Degree=6）、ACTA2（Degree=3）、PTGS1（Degree=2）。
2.5 KEGG通路分析和GO分析 使用DAVID数据库对大黄素治疗脑缺血中风的靶点进行KEGG通路分析和GO分析，最终得到29条KEGG通路，其中P<0.01的通路有12条，涉及癌症中的蛋白聚糖通路（Proteoglycans in Cancer）、癌症中的microRNAs通路（microRNAs in Cancer）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信号通路（MAPK Signaling Pathway）等。见表1。47条GO生物过程（Biological Progress，BP），其中P<0.01的生物过程有14条，涉及凋亡过程的负调控（Negative Regulation of Apoptotic Process）、基因表达的正调控（Positive Regulation of Gene Expression）、血压的调节（Regulation of Blood Pressure）、糖皮质激素反应（Response to Glucocorticoid）、细胞对缺氧的反应（Cellular Response to Hypoxia）、蛋白磷酸化的正调控（Positive Regulation of Protein Phosphorylation）等，8条富集的细胞组分（Cellular Component，CC），其中P<0.01的细胞组分有3条，分别为蛋白质复合体、膜筏、内质网，9条富集的细胞功能（Molecular、Function，MF），其中P<0.01的细胞功能有2条，分别为前列腺素内过氧化物合酶活性（Prostaglandin-endoperoxide Synthase Activity）和蛋白酶结合（Protease Binding）。见表2。利用Cytoscape_v3.2.1软件构建通路与之相关的靶点网络。见图5。其中MYC（Degree=16），PTGS2（Degree=15），TP53（Degree=14），CASP3（Degree=13），TNF（Degree=12）的Degree值较大，表明大黄素可能主要通过这些蛋白作用于各种通路。
2.6 分子对接 分子对接作为一种应用广泛的虚拟筛选方法，其可以预测小分子配体与合适的靶点结合位点的结合构象。反向分子对接是一种新的方法，可以通过对接实现与虚拟筛选相反的功能，是根据单配体多靶点的概念筛选蛋白与小分子化合物的方法[12]。Sybyl软件涵盖药物设计的各个方面，应用分子对接软件Sybyl可以评估大黄素与靶点之间的结合活性强弱。经过蛋白晶体结构下载及预处理，其中ACTA2沒有搜索到相关晶体结构，最终共得到处理好的蛋白靶点9个，采用Sybyl 2.0进行大黄素和其治疗脑缺血中风靶点[CASP3（PDB ID：2J32），KDR（PDB ID：3VO3），PTGS1（PDB ID：6N4E），TNF（PDB ID：5UUI），MMP9（PDB ID：6ESM），PRKCE（PDB ID：2WH0），PTGS2（PDB ID：5F19），MYC（PDB ID：6G6K），TP53（PDB ID：3D06）]进行对接，得到对接分数。见表3。Cscroe综合了多种打分函数，代表了活性位点和配体的亲和力，得分包含0，1，2，3，4，5。其中0分表示配体与受体之间无法稳定结合，3～4分表示二者结合相对稳定，需要进一步考虑，5分表示配体与受体之间有较好的亲和力[11]。因此通过以Cscore值作为评价大黄素与靶点之间的相互作用，可以看出CASP3、KDR、PTGS1 3种蛋白靶点与大黄素的结合能力最强，其中大黄素与CASP3的结合活性位点氨基酸残基为A/ARG207、A/ARG64、A/HIS121、A/SER205，大黄素与KDR的结合活性位点氨基酸残基为A/ASP814，大黄素与PTGS1的结合活性位点氨基酸残基为A/CXL200、A/ARG14、A/THR159。见图6。TNF、MMP9与大黄素的结合活性相对较好。
3 讨论
网络药理学近些年来已成为药物研究领域日益重要的研究热点，反向分子对接技术也逐渐成为中医药现代化的有益工具，它可以将小分子药物与大分子靶标的潜在结合口袋进行对接，根据结合的紧密程度筛选小分子药物的靶点。中风是全球死亡和长期残疾的主要原因[13-14]，大量证据表明，氧化应激和炎症反应在脑卒中的病理生理中起着重要作用[15-16]。
通过对大黄素治疗脑缺血中风的网络药理学研究，我们发现ACTA2、CASP3、KDR、MMP9、MYC、PRKCE、PTGS1、PTGS2、TNF、TP53是其潜在的关键治疗靶点，主要涉及通路12条，与炎症反应、细胞凋亡、MAPK信号通路等相关通路有关，其发挥作用可能是通过这些通路实现的。另外据有关实验报道：大黄素具有良好的抗炎作用，能够降低血清炎症介质肿瘤坏死因子（TNF-a）和白细胞介素-1（IL-1）的水平，通过超声心动图和组织病理学检查可发现实验性自身免疫性心肌炎大鼠经大黄素治疗后左心室功能得到明显改善，心肌炎严重程度显著减轻[17]。Li等[18]通过调节Cx43和AQP4在脑缺血/再灌注（I/R）模型大鼠中的表达，评估了人参皂苷和大黄素在I/R模型大鼠中的独立及联合作用，实验结果表明，人参皂苷和大黄素的单独或联合使用均能缓解神经功能缺损评分（NDS），血脑屏障通透性和梗死面积。
另外，通过对大黄素治疗脑缺血性中风的靶点在大脑细胞中的分布表达情况分析，结果发现主要集中在星形胶质细胞、内皮细胞和小胶质细胞表达。根据相关报道可知脑缺血中风后，在梗死周围区域增殖的反应性星形胶质细胞对神经元的存活起着有益的作用[19-20]，Mukda等[21]的研究发现MCAO/MACO/R期间桥粒相关蛋白表达的增加反映了皮质和纹状体梗死周围区域裂解的Caspase-3的减少，这表明了桥粒相关蛋白（Pinin）在缺血性卒中中的抗凋亡作用。TP53至少有12种亚型，它们可以促进或抑制p53的全长活性或者具有独立的功能，在这些亚型中，△133p53是最好的内源性抑制剂细胞衰老的特征[22-23]，Turnquist等[24]的研究表明△133p53可能具有潜在的治疗价值，能够防止星形胶质细胞衰老，促进DNA修复，抑制星形胶质细胞介导的神经炎症反应。由此可推测大黄素治疗脑缺血中风的机制可能与CASP3的表达、TP53的表达及星形胶质细胞在脑缺血中的作用有着不可分割的联系。KDR是一种2型血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR-2），相关信号通路能够维持内皮细胞的成活及增加血管的通透性[25]，而內皮细胞、周细胞和星形细胞相互作用形成的血脑屏障在维持脑内稳态中起着重要作用[26]，一些研究表明血脑屏障功能障碍是脑缺血性中风、癫痫、阿尔茨海默病等的重要影响因素[27]。由此可推测大黄素治疗脑缺血中风的机制可能与KDR在内皮细胞中的表达有关。此外，小胶质细胞是大脑的主要免疫细胞，是最先对缺血性中风引起的病理生理变化做出反应的细胞，在缺血性脑中风的治疗中起关键调节作用[28]，推测大黄素治疗脑缺血中风的机制可能与MYC等靶点蛋白在小胶质细胞中的表达情况有关。
经过反向分子对接，结果表明CASP3、KDR、PTGS1 3个靶蛋白与大黄素的结合最好，TNF、MMP9相对较好，其中Caspase-3（CASP3）在凋亡过程中起着重要作用，Rosell等[29]的研究表明其与脑缺血中风之后梗死灶的生长相关。Ahn等[30]的研究表明大黄素可以显著减少光照血栓中风模型小鼠的梗死体积并改善运动功能，证实了Bcl-2/Bax，活性caspase-3、磷酸化（p）Akt，p-CREB和BDNF的表达水平对大黄素在脑缺血中有效的神经保护作用。Leung等[31]通过研究大黄素在体外和体内对缺血的神经保护作用，发现大黄素减少局灶性脑缺血损伤后的梗死体积和细胞凋亡可能是通过激活ERK-1/2信号通路，提高Bcl-2和谷氨酸转运蛋白-1（GLT-1）的表达，抑制激活的半胱天冬酶-3的活性实现的。且有研究还证明活化的Caspase-3是急性脑损伤后细胞凋亡的关键因素，有可能与慢性神经退行性进展有一定的联系[32]。血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）是一种2型血管内皮生长因子受体，被认为是促使血管生成的一个关键因素，在脑缺血损伤中扮演着调节和保护神经细胞的角色[33]。Feng等[34]的研究认为VKORC1和Chr.9p21.3以及VEGFA和KDR 2种新的遗传相互作用与卒中的风险、亚型和卒中的未来预后有关。前列腺素G/H合成酶（PTGS1）是花生四烯酸代谢途径中的酶，催化花生四烯酸转化生成前列腺素，而前列腺素是炎症反应的关键介质，在血小板中，前列腺素能够转化为TXA2，从而促进血小板活化和聚集[35]。Yi等[36]分析了297例动脉粥样硬化血栓性卒中患者和291例对照组的PTGS1、PTGS2、TBXAS1、PTGIS、PTGES的11个变异及基因-基因间的相互作用，结果显示PTGS2rs20417、PTGS1rs5602和TBXAS1rs41708 3位点的高危交互作用是动脉粥样硬化血栓性卒中的独立危险因素。此外，Zhao等[37]的研究也提到PTGS1与治疗中风的机制有关。肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）作为一种可溶性和跨膜蛋白，在脑卒中后炎症反应中起着重要作用，其实一种多功能的炎症介质，从发展到修复和长期验证效应，参与脑缺血中风的所有阶段[38]。MMPs是一组依赖于锌和钙的内肽酶，能够降解ECM的所有成分，包括层粘连蛋白、胶原和纤连蛋白，以及许多其他靶点，其中MMP2和MMP9在卒中中研究最为广泛，基质金属蛋白酶（MMP9）在多种心血管疾病中发挥着重要的作用[39]，其降解细胞外基质成分，引发中风[40]、动脉粥样硬化[41]等心血管疾病的发生。MMP9是一种明胶酶，通常被认为是酶原的一种形式，大脑中许多细胞都能分泌MMP9酶原[42]，有研究发现缺血急性期之后，在亚急性期间，浸润的白细胞会进一步释放细胞因子、趋化因子和过量的ROS，促进基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，特别是MMP9，且MMP的激活可引起急性缺血性中风后出血转化相关的血脑屏障损伤[43-44]。
由此可见，大黄素治疗脑缺血中风的机制预测结果具有一定的可靠性，主要作用于CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9靶点，在大脑星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞等中有不同程度的表达，涉及12条KEGG相关通路，14条GO生物过程，3条GO细胞组分，2条GO细胞功能，表明大黄素可以通过多通路、多靶点对脑缺血中风进行治疗。
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（2019-10-10收稿 责任编辑：王明）
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