丹参酮ⅡA通过NLRP3/Caspase-1信号通路对心肌成纤维细胞的保护作用
郑鹏 王俊帅 占大钱 王敏 夏海发 刘旭东 明晓青 周代星 冯俊
摘要 目的：探討丹参酮ⅡA对心肌成纤维细胞损伤的保护作用及可能机制。方法：分离和培养大鼠心肌成纤维细胞（Cardiac Fibroblast，CFs）。以脂多糖（LPS）刺激CFs建立脓毒症心肌损伤体外模型，以不同浓度丹参酮ⅡA预处理CFs 30 min后，给予LPS刺激，设对照组，LPS模型组，LPS+不同浓度TSA（2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L）组;采用蛋白质免疫印迹试验法（Western blotting）检测CFs的NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清中IL-1β和IL-18的含量。结果：LPS刺激24 h后，CFs的NLRP3蛋白的表达水平最高。LPS模型组NLRP3和Caspase-1蛋白的表达较对照组明显升高（P<0.01）。与LPS模型组比较，丹参酮ⅡA（10 μmol/L、50 μmol/L）处理组NLRP3和Caspase-1蛋白的表达均明显降低（P<0.05）;丹参酮ⅡA处理组的IL-1β和IL-18水平均明显低于LPS模型组（P<0.05）。结论：丹参酮ⅡA能抑制LPS诱导的心肌成纤维细胞内NLRP3/Caspase-1炎症反应信号通路分子的表达，这可能是其保护心肌细胞的分子机制之一。
关键词 丹参酮ⅡA;脓毒症;心肌成纤维细胞;NLRP3/Caspase-1信号通路
Protective Effect of Tanshinone ⅡA on Cardiac Fibroblasts through the NLRP3/Caspase-1 Signaling Pathway
ZHENG Peng1，WANG Junshuai1，ZHAN Daqian1，WANG Min1，XIA Haifa2，LIU Xudong1，MING Xiaoqing1，ZHOU Daixing1，FENG Jun1
（1 Department of Emergency，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，China; 2 Department of Anesthesia，Wuhan Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，China）
Abstract Objective：To explore the protecting role and mechanism of tanshinone ⅡA in lipopolysaccharide （LPS）-induced cardiac fibroblast injure.Methods：Rat cardiac fibroblasts （Cardiac Fibroblast，CFs） were Isolated and cultured.Lipopolysaccharide （LPS） was used to stimulate CFs to establish an in vitro model of septic myocardial injury.After CFs were pretreated with different concentrations of Tanshinone ⅡA for 30 min，they were given LPS stimulation.A control group，an LPS model group and LPS+different TSA （2 μmol/L，10 μmol/L，50 μmol/L） were set up.Western blotting was used to detect the NLRP3 and Caspase-1 protein expression levels of CFs，and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the content of 1β and IL-18.Results：After 24 h of LPS stimulation，the expression level of NLRP3 protein in CFs was the highest.The expression of NLRP3 and Caspase-1 protein in the LPS model group was significantly higher than that in the control group （P<0.01）.Compared with the LPS model group，the expressions of NLRP3 and Caspase-1 protein in the Tanshinone ⅡA （10 μmol/L，50 μmol/L） treatment group were significantly reduced （P<0.05）; the level of IL-1β and IL-18 in the Tanshinone ⅡA treatment group was significantly lower than that of the LPS model group （P<0.05）.Conclusion：Tanshinone ⅡA may be a potent agent to protect against myocardial dysfunction in sepsis by regulating NLRP3/Caspase-1 signaling pathway.
Keywords Tanshinone ⅡA; Sepsis; Cardiac fibroblast; NLRP3/Caspase-1 signaling pathway
中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.011
脓毒症是宿主对感染的反应异常，产生危及生命的器官功能损害，大约50%的脓毒症患者存在心脏功能损害[1]。脓毒症引起心肌损害的机制尚不明确。目前普遍认为脓毒症患者体内过度的炎症反应可能参与了心脏功能损害的过程[2-3]。在心脏的细胞组成中，心肌细胞占比低于50%，而心脏成纤维细胞（CFs）占比则高达60%。研究显示心肌成纤维细胞发挥着感受损伤和炎症反应的前哨作用[4]。
Nod受体蛋白3（NLRP3）是一类重要的胞质内受体蛋白，它对多种物理和化学刺激做出反应[5-6]，与Caspase-1形成的炎性小体可导致炎症介质IL-1β和IL-18的成熟[7]。NLRP3炎性小体及其下游炎症介质IL-1、IL-18在冠状动脉疾病或心肌梗死患者中的表达升高[8]。NLRP3炎性小体主要表达在心肌成纤维细胞上，心肌细胞上则很少[9]。心肌成纤维细胞上NLRP3炎性小体的过度激活参与了心肌缺血再灌注损伤过程。在脓毒症心肌损伤动物模型中，NLRP3、Caspase-1均显著上调[10]。
丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA）是从中药丹参里提取出的一种主要成分，广泛运用于心血管疾病中[11]。研究表明，丹参酮ⅡA能通过抑制NADPH氧化酶2从而减轻LPS诱导的小鼠心肌纤维化[12]。此外，丹参酮ⅡA可抑制脑缺血再灌注损伤过程中NLRP3的表达[13]。动物实验中，丹参酮ⅡA能改善脓毒症小鼠心脏收缩功能障碍[14]，降低肌钙蛋白I、肌钙蛋白T等心肌损伤指标[15]。其作用机制未完全明确。本研究通过建立体外脓毒症心肌损伤模型，探讨丹参酮ⅡA能否影响心脏成纤维细胞上NLRP3炎性小体及其下游炎症介质。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 Wistar大鼠，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技公司[许可证SCXK（京）2019-0008];本次动物实验经华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：HSZP-PJ-2020-001-01），符合动物伦理委员会的要求，饲养于同济医院动物实验中心，饲养温度20～25 ℃，湿度55%，12 h明暗交替环境，标准饲料和水喂养，术前禁食不禁水。
1.1.2 药物 丹参酮ⅡA（中国药品生物制品检定所，批号：110766-201721）。
1.1.3 试剂与仪器 大鼠IL-1β ELISA试剂盒（R&D Systems公司，美国，货号：RLB00），IL-18 ELISA试剂盒（R&D Systems公司，美国，货号：DY521-05），NLRP3抗体（Abcam公司，美国，货号：ab263899），Caspase-1抗体（Abcam公司，美国，货号：ab74279），β-actin抗体（Abcam公司，美国，货号：ab115777），电转仪（北京六一仪器公司，型号：DYCZ-40），电泳槽（北京六一仪器公司，型号：DYCZ-24DN），酶标仪（Thermo，美国，型号：Multiskan MK3）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将Wistar大鼠麻醉，摘除心脏，酶解（胶原酶II，2 mg/mL）心肌组织。细胞悬液通过尼龙过滤器（70 μm）后，磁珠技术去除内皮细胞。随后将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱培养90 min。贴壁细胞以CFs为主，移除非贴壁细胞（心肌细胞）。收集所得细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养。经鉴定成纤维细胞标志物（ER-TR7）染色阳性细胞达95%[16]。将第一代至第三代之间的细胞用于实验。取对数生长期的CFs，以细胞浓度1×108/mL接种于10 cm2培养皿中，培养24 h，分为对照组，LPS模型组，丹参酮ⅡA 2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L）处理组。
1.2.2 给药方法 将LPS（50 μg/mL）加入DMEM-F12培养基刺激CFs;盐水作为对照添加到培养基中。为确定NLRP3炎性小体激活的最佳时间窗，预实验分别用LPS刺激CFs 4、8、12、24 h，再加入3 mmol/L ATP作用30 min，以激活NLRP3炎性小体[17]。根据结果，将LPS刺激24 h的CFs用于后续实验。丹参酮ⅡA处理组以丹参酮ⅡA预处理细胞30 min后加入LPS培养24 h。再加入3 mmol/L ATP作用30 min。每个浓度梯度设3个复孔。
1.2.3 检测指标与方法 1）Western blotting检测CFs中NLRP3和Caspase-1蛋白的表达水平：将培养皿中的细胞用PBS洗涤后加入预冷PBS，刮下细胞，1 000 r/min，离心半径13 cm，4 ℃离心10 min，向沉淀中加入300 μL细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。行SDS-PAGE凝膠电泳。电泳后，将蛋白转移至PVDF膜。封闭2 h后，加入1∶1 000稀释的NLRP3和Caspase-1一抗和1∶2 000稀释的内参β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜，1∶4 000稀释的二抗室温孵育2 h，TBST洗膜。用化学发光法显色，凝胶成像系统采集图像。2）ELISA检测细胞上清中IL-1β和IL-18的含量：取对数生长期的CFs，以细胞浓度1×105/mL接种于96孔板中，培养24 h，随后的分组和处理同上。按ELISA试剂盒说明书操作步骤检测各组细胞上清IL-1β和IL-18含量。
1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS诱导心肌成纤维细胞NLRP3蛋白的表达 结果显示，LPS刺激24 h NLRP3蛋白的表达最高（P<0.05）。因此，将LPS刺激24 h的CFs用于后续实验。见图1。
2.2 丹参酮ⅡA抑制LPS诱导心肌成纤维细胞NLRP3和Caspase-1蛋白表达 LPS组NLRP3和Caspase-1蛋白的表达较对照组明显升高（P<0.01）。与LPS模型组比较，各浓度梯度的丹参酮Ⅱ
A处理组细胞内NLRP3（图2A）和Caspase-1（图2B）蛋白的表达均降低，且丹参酮ⅡA浓度越高，NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平越低。50 μmol/L丹参酮ⅡA作用时，NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平较LPS模型组差异有统计学意义（P<0.01）。见图2。
2.3 丹参酮ⅡA抑制LPS诱导心肌成纤维细胞IL-1β和IL-18的释放 LPS刺激CFs后，细胞上清IL-1β和IL-18水平较对照组明显升高[IL-1β：（383.8±36.4）pg/mL比（16.6±5.3）pg/mL，IL-18：（375.6±32.6）pg/mL比（18.5±7.2）pg/mL]。各浓度梯度丹参酮ⅡA处理组IL-1β和IL-18水平较LPS模型组均明显降低（P<0.05）。10 μmol/L及50 μmol/L丹参酮ⅡA处理组IL-1β和IL-18水平较LPS模型组降低更显著[IL-1β：（207.4±28.5）pg/mL，（112.6±15.8）pg/mL比（383.8±36.4）pg/mL;IL-18：（203.7±21.5）pg/mL，（106.9±16.7）pg/mL比（375.6±32.6）pg/mL]（P<0.01）。见图3。
3 讨论
脓毒症是一种发病机制复杂的疾病，是临床危重症患者重要的死亡原因之一。严重脓毒症和脓毒症休克是以血流动力学改变和组织低灌注导致多器官功能障碍为特征。其中心脏是重要的受影响的器官。明确脓毒症心肌损伤的机制对脓毒症的治疗非常重要。
研究表明，失控的炎症反应在脓毒症心肌损伤中发挥重要作用[2-3，18]。NLRP3是一种胞质内的模式识别受体，它可以被感染性和非感染性信号激活。NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）形成炎性小体，使天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，促进IL-1β和IL-18的成熟和释放[7，19]。NLRP3炎性小体主要存在于心脏成纤维细胞中，心肌细胞上则很少。而心脏成纤维细胞与心肌细胞存在交互作用，体外实验发现药物或基因层面抑制心脏成纤维细胞NLRP3炎性小体能增加心肌细胞环磷酸腺苷（cAMP）水平[9，20]，升高的心肌细胞cAMP水平间接反映了心脏收缩功能的改善。丹参酮ⅡA是治疗心血管疾病的临床常用中药，近年来在脓毒症中的研究也越来越多[14，21-22]。在脓毒癥小鼠模型中，丹参酮ⅡA能降低外周血炎症介质TNF-α和IL-1β水平[14]，降低心肌活性氧族水平，改善心脏收缩功能。另一项研究中发现丹参酮ⅡA能改善LPS导致的血流动力学紊乱[21]。然而丹参酮ⅡA在脓毒症中的机制仍未完全明确。本研究通过LPS刺激心肌成纤维细胞构建体外脓毒症心肌损伤模型，发现LPS刺激下，心肌成纤维细胞NLRP3/Caspase-1炎症反应信号通路激活，下游炎症介质IL-1β和IL-18释放增加。丹参酮ⅡA预处理心肌成纤维细胞，能有效抑制LPS诱导的心肌成纤维细胞NLRP3和Caspase-1蛋白表达，减少IL-1β和IL-18释放，其作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而抑制程度增加，显示丹参酮ⅡA能通过作用于心脏成纤维细胞NLRP3信号通路来发挥心脏保护作用。
本研究从细胞层面探索丹参酮ⅡA的在脓毒症心肌损伤中的心脏保护作用机制，为丹参酮ⅡA在脓毒症的治疗中运用提供了一定的分子理论基础。
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（2020-07-17收稿 責任编辑：王明）
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