核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒复制中的作用
殷杰 赵永祥 薛江东 刘锴 李彬 马德慧
摘要：
为研究宿主细胞核糖体蛋白L12（RPL12）在猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）复制中的作用，本研究通过荧光定量PCR和Western-blotting等方法，检测了PRRSV感染对Marc-145细胞中RPL12表达的影响，以及过表达或敲减RPL12对PRRSV复制的影响。结果显示，PRRSV感染可上调Marc-145细胞中RPL12基因的表达。过表达RPL12可促进PRRSV的复制，而敲减RPL12可抑制PRRSV的复制。通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜检测，进一步研究发现RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，并共定位于细胞质中。本研究首次发现了宿主蛋白RPL12能够促进PRRSV复制，并与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，为进一步研究PRRSV的感染与复制机制以及与宿主的相互作用提供了新的切入点，为抗病毒药物的研发提供了有益的探索。
关键词：
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）;核糖体蛋白L12（RPL12）;PRRSV GP2b蛋白
中图分类号：
S852.65 文献标识码：
A 文章编号：
1000-4440（2021）03-0686-08
Role of ribosomal protein L12（RPL12） in porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication
YIN Jie1，2， ZHAO Yong-xiang2， XUE Jiang-dong1， LIU Kai1， LI Bin2， MA De-hui1
（1.College of Animal Science and Technology， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000， China;2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）
Abstract：
To study the role of host cell ribosomal protein L12 （RPL12） in the replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， real-time quantitative PCR and Western-blotting were performed to detect the effect of PRRSV infection on the expression of RPL12 in Marc-145 cells and the effect of over-expression and knockdown of RPL12 on the replication of PRRSV. The results showed that PRRSV infection could up-regulate the expression of RPL12 in Marc-145 cells. Over-expression of RPL12 promoted the replication of PRRSV， while knockdown of the RPL12 inhibited the replication of PRRSV. Through co-immunoprecipitation and confocal microscopy analysis， further study found that RPL12 protein interacted with PRRSV GP2b protein and co-localized in the cytoplasm. This study reported for the first time that the host protein RPL12 could promote PRRSV replication and interact with PRRSV GP2b protein， which provides a new cut-in point for further research on the mechanism of PRRSV infection and replication， and also provides a beneficial exploration for the development of antiviral drugs.
Key words：
porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）;ribosomal protein L12 （RPL12）;PRRSV GP2b protein
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原体[1]，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，是冠状病毒科成员[2]，在分类上属于动脉病毒属[3]。该病毒主要引起怀孕母猪早产、流产以及木乃伊胎等繁殖障碍，也会引起公猪精液质量下降，仔猪和育肥猪呼吸困难等症状[4]。病毒在扁桃体、肺和淋巴器官中持续复制，可抑制宿主先天免疫[5-8]。另外，PRRSV经常与猪圆环二型（PCV2）猪瘟等病毒和副猪嗜血杆菌等细菌存在混合感染[9-11]，而且PRRSV存在毒力返强、变异以及与临床毒株发生重组的风险，防控难度大，给中国养猪业造成了巨大损失。目前，PRRSV感染与复制机制还未完全闡明，特别是宿主蛋白质在病毒复制中的作用的研究尚不深入，解析这些问题有助于理解PRRSV的致病与免疫机制，有助于制定PRRSV防控措施。
PRRSV基因组包含11个已知的开放阅读框（ORFs）：
ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7、ORF5a和transframe （TF） ORF[12-14]。ORF1a和ORF1b的长度约占病毒基因组的三分之二，编码病毒复制所必需的16种非结构蛋白（NSPs）[15]，这些非结构蛋白主要参与基因组复制和亚基因组的合成。ORF2～ORF7编码8种结构蛋白[GP2、GP2b、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N]，其中GP2b蛋白完全包裹在ORF2中，是一种小的、非糖基化蛋白质，大小只有10 000，但GP2b相对大量存在于病毒粒子中，在2种类型毒株间高度保守[16]，是病毒粒子的重要组成部分[17]。GP2b已被证明与GP4共价结合，而GP3与GP4结合形成病毒粒子表面的异三聚体复合物，被认为参与病毒的侵入。因此，GP2b在PRRSV的感染与复制过程中可能发挥着重要作用。前期研究中，我们利用PRRSV GP2b作为诱饵蛋白质，通过酵母双杂交试验在猪肺泡巨噬细胞（PAM）cDNA文库中筛选到了与GP2b蛋白相互作用的核糖体蛋白L12（RPL12），而RPL12在PRRSV复制过程中的作用尚未明确，需要进一步探索。
本研究中，我们发现PRRSV感染可上调Marc-145（非洲绿猴胚胎肾细胞）细胞中RPL12基因的表达。为了探索RPL12基因与PRRSV复制之间的关系，我们过表达和敲减了RPL12基因，发现过表达RPL12基因促进了PRRSV的复制，相反，敲减RPL12抑制了PRRSV在Marc-145细胞中的复制。进一步研究发现RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，并共定位于细胞质中。本研究首次发现了宿主蛋白质RPL12能够促进PRRSV复制，并与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，为进一步研究PRRSV的复制机制及与宿主的相互作用提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 细胞、病毒、抗体 Marc-145、人胚肾A细胞（293A）、PRRSV JS-15毒株、PRRSV N蛋白抗体均由本实验室保存。鼠抗β-actin单克隆抗体购自爱博泰克生物科技有限公司。兔抗RPL12单克隆抗体、鼠抗HA单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。鼠单抗FLAG单克隆抗体、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、DIPA染色液购自碧云天生物技术公司。FITC-山羊抗小鼠IgG、CY3-山羊抗小鼠IgG购自博士德生物工程有限公司。
1.1.2 主要试剂 大肠杆菌感受态Trans 5α购自北京全式金生物技术有限公司，干扰片段由锐博生物科技有限公司合成，Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit购自广州飞扬生物工程有限公司，总RNA提取试剂盒（双柱型）购自广州美基生物科技有限公司，5×HiSciript II、qRT SuperMix II反转录酶、AceQ qPCR Probe Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，细胞高糖培养液DMEM购自上海源培生物科技股份有限公司，SuperSignalTM West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate购自赛默飞世尔科技公司，其余试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 重组质粒的构建和鉴定 本研究中构建了pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS-GP2b-HA重组质粒。参考GenBank中猪源核糖体蛋白基因L12碱基序列（AY550045.1），设计引物RPL12-F、RPL12-R（表1）。以Marc-145细胞总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用RPL12引物扩增基因片段，扩增片段产物和pCAGGS载体经EcoR I和Xho I限制性内切酶双酶切后胶回收，利用T4酶连接的方法将RPL12基因片段克隆到pCAGGS载体中，构建N端带有FLAG标签的重组质粒pCAGGS-RPL12-FLAG。
通过RNA提取试剂盒提取PRRSV总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，以PRRSV-GP2b-F、PRRSV-GP2b-R引物扩增GP2b基因片段，Kpn I和Xho I限制性内切酶双酶切GP2b片段和pCAGGS载体，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，确定其大小后紫外灯下切割目的片段，然后回收。用T4 DNA连接酶将GP2b目的片段及pCAGGS载体片段37 ℃连接2 h，连接产物在Trans 5 α感受态细胞中转化，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选克隆，构建N端带有HA标签的重组质粒pCAGGS-GP2b-HA。以上重组质粒分别进行双酶切和测序验证。
1.2.2 质粒转染 Marc-145细胞按1∶3比例传代，每孔500 μl细胞悬液滴加到24孔细胞板中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，细胞密度达到70%左右时进行转染。按照Lipofectamine 3000操作说明转染pCAGGS-RPL12-FLAG重组质粒，同时转染pCAGGS空载体作为对照，具体步骤如下：分别在2个无菌EP管中加入250 μl Opti-MEM，1个加入2 μl Lip3000，另1个加入2 μl P3000和1 μg质粒，分别室温孵育5 min后，将Lip3000混合液滴加到p3000混合液中，室温孵育10 min，将孵育完成后的混合物逐滴加入到培养板，最后轻轻晃动培养板混匀培养基，在37 ℃ 、体积分数为5%的CO2培养箱中培养36 h，收取细胞进行检测。
1.2.3 si-RNA转染 Marc-145细胞密度达到70%左右时进行转染。按照Lipofectamine 3000操作说明转染si-RNA，具体步骤如下：取无菌EP管，加入3 μl的转染试剂Lip3000与50 nmol/L的si-RNA，加入Opti-MEM补至50 μl。同时转染50 nmol/L的si-NC作为对照。用移液枪轻轻混匀，室温孵育10 min，將转染混合液逐滴加入到细胞培养板中，最后轻轻晃动培养基，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养36 h，收取细胞进行检测。
1.2.4 病毒接种与病毒滴度检测 质粒或si-RNA转染24 h后，将PRRSV（MOI=0.1）接种至Marc-145细胞中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中吸附1 h，弃去病毒液，用无菌PBS再次清洗细胞后加入2%血清DMEM维持液。病毒接种36 h后收取细胞，细胞反复冻融3次，离心去除细胞碎片，取上清液-80 ℃保存。将Marc-145细胞接种到96孔板，当细胞长成单层后，用无血清DMEM 1∶10稀释PRRSV病毒液，每个稀释浓度8次重复，每孔150 μl病毒液，接种到细胞中，在37 ℃体积分数的5%的CO2培养箱中培养3 d以上，逐日观察病变，记录病变孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒TCID50。
1.2.5 Western-blotting檢测 将Marc-145细胞用蛋白裂解液裂解，加入1×SDS loading buffer金属浴100 ℃煮沸10 min，充分裂解细胞获取蛋白质样品。每孔加入10 μl细胞裂解蛋白质，经12.5%硫酸十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭液室温孵育2 h，1×PBST洗膜3次，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜3次，HRP标记二抗在室温孵育1 h，洗膜3次，利用ECL曝光系统观察结果。
1.2.6 实时荧光定量PCR检测 按照Hipure Total RNA MiNi Kit总RNA小提试剂盒收集细胞并提取细胞中的总RNA，参照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 进行RNA逆转录，以获得的cDNA为模板进行扩增，PCR反应总体系为20.0 μl，10.0 μl 2×AceQ qPCR Probe Master Mix，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物，0.2 μl 10 μmol/L Taq man Probe，0.4 μl 50×ROX Reference Dye，1.0 μl cDNA，7.6 μl水。PCR反应程序：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。进行PRRSV拷贝数的Real-time RT-PCR检测，根据标准曲线进行病毒拷贝数的绝对荧光定量计算，所有处理组均重复检测3次，扩增引物见表1。TanMan探针序列为5′-FAM TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-3′。
1.2.7 激光共聚焦检测 将Marc-145细胞经胰酶消化后均匀铺于带有细胞爬片的24孔细胞板中，当细胞汇合度约为70%时，pCAGGS-RPL12-FLAG和pCAGGS-GP2b-HA共转染1 μg，同时将2种质粒分别和空载体共转染1 μg，并设立不转染质粒细胞孔为阴性对照，转染36 h后，弃掉培养基，PBS清洗细胞2次，用预冷的80%乙醇溶液4 ℃固定细胞30 min，弃掉固定液，PBS洗3次，Mouse-Anti-FLAG按照1∶1 000（体积比）稀释，，Rabbit-Anti-HA按照1∶500（体积比）稀释，混合后滴加到细胞孔中，在恒温孵育箱中37 ℃孵育2 h，PBS清洗细胞3次，使用FITC-荧光二抗（1∶400）37 ℃孵育1 h，PBS清洗细胞3次，用DAPI核染料染色5 min，PBS清洗细胞3次，取出爬片，用固封液将爬片固定在载玻片上，放置在暗处晾干，使用Zessi激光共聚焦显微镜观察结果。
1.2.8 Co-IP检测 pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS-GP2b-HA重组质粒在细胞汇合率达到约70%的24孔Marc-145细胞板中共转染1 μg，pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS空载体共转染1 μg。37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养30 h后，每孔加入70 μl蛋白质裂解液收集细胞，5 000 r/min离心5 min以去除细胞碎片，取100 μl上清液加入SDS buffer煮沸为对照组，其余上清液与anti-HA抗体（1～1 000）4 ℃轻摇孵育过夜，再与protein A+G Agarose 4 ℃缓慢摇动偶联4 h。免疫复合物被沉淀，采用Western blotting检测结果。
1.3 数据分析
采用GraphPad Prism 7.0软件进行数据统计分析，利用t检验法统计各组标准差及组间差异显著性。P<0.05时差异显著，标记为*，P<0.01时差异极显著，标记为**。
2 结果与分析
2.1 PRRSV感染促进Marc-145细胞中RPL12的表达
为了检测PRRSV感染对细胞内RPL12表达的影响，将PRRSV（MOI=0.1）接种到Marc-145细胞，分别于感染后12 h、24 h和36 h收集细胞，通过荧光定量和Western-blotting方法检测内源基因RPL12表达的变化，结果显示，随着PRRSV的复制，RPL12的转录水平（图1A）和蛋白质表达水平（图1B）均明显增强，说明PRRSV感染能够上调细胞中RPL12的表达。
2.2 过表达RPL12促进PRRSV在Marc-145细胞中的复制
将pCAGGS-RPL12-FLAG重组质粒转染至细胞密度达到70%的Marc-145细胞中，24孔Marc-145细胞中，同时转染空载体质粒作为对照，转染24 h后将PRRSV（MOI=0.1）接种到Marc-145细胞后，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养细胞，分别在接种病毒后1 h、12 h、24 h、36 h收取细胞，用Western-blotting和荧光定量PCR方法检测病毒含量，结果显示，PRRSV感染后12 h、24 h、36 h，过表达RPL12对PRRSV复制都有促进作用（图2A）（P<0.01）。感染后36 h的细胞中PRRSV的蛋白质含量（图2B）和病毒滴度（图2C）均极显著增加（P<0.01）。这些结果说明过表达RPL12对PRRSV的增殖有促进作用。
2.3 敲减RPL12抑制PRRSV在Marc-145细胞中的复制
转染干扰片段24 h后，将PRRSV（MOI=0.1）接种到Marc-145细胞中，分别在1 h、 12 h、24 h、36 h后收取细胞样品，提取并反转录500 ng RNA作为模板，利用荧光定量方法检测PRRSV N基因的变化，结果显示，PRRSV感染后的12 h、24 h、36 h，敲减RPL12对PRRSV复制都有抑制作用（图3A）（P<0.05或 P<0.01）。同样的，36 h收取的细胞中PRRSV的N蛋白含量（图3B）、病毒拷贝数（图3C）均降低。这些结果说明敲减RPL12会抑制PRRSV的增殖。
2.4 RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白的相互作用
為了验证RPL12与GP2b之间的相互作用，将pCAGGS-RPL12-FLAG 和pCAGGS-GP2b-HA质粒共转染至Marc-145细胞，并设置空载体共转染组作为对照。转染30 h后用RIPA蛋白裂解液收取细胞进行co-IP分析。12 000 r/min离心5 min去除细胞碎片，取离心后的上清液加入鼠抗HA单克隆抗体置于侧摆摇床上4 ℃孵育过夜，再加入 protein（A+G） 琼脂糖凝珠偶联4 h，洗涤后收取样品进行蛋白质印迹分析。结果表明，RPL12与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用（图4）。
2.5 RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白共定位于细胞质
为了进一步验证RPL12与PRRSV GP2b蛋白的相互作用，将pCAGGS-RPL12-FLAG和pCAGGS-GP2b-HA重组质粒共转染至Marc-145细胞36 h后，进行细胞固定，洗涤3次后，共孵育Flag和HA抗体，不同荧光标记二抗孵育后，利用激光共聚焦检测RPL12与PRRSV GP2b在Marc-145细胞中的定位。结果显示，RPL12在细胞质和细胞核中均有定位，GP2b主要定位于细胞质中。当RPL12与GP2b共表达时，两者在细胞质中存在共定位（图5）。
3 讨论
2006年至今，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在中国大部分地区持续蔓延[18]，是影响中国养猪产业最严重的病毒之一[19]。近些年，PRRSV类NADC30毒株迅速在中国大部分地区流行。由于PRRSV具有抗原变异[20-21]、抗体依赖性增强、免疫抑制[22-23]以及在猪群中常持续性感染等特点，PRRSV的防控及根除具有较大难度。目前对PRRSV感染与复制机制了解甚少，对病毒的一些功能蛋白的解析也很有限，宿主蛋白在PRRSV复制中的作用研究也不深入，这些问题均需要进一步研究，以便阐明PRRSV感染与复制机制，为PRRSV防控措施的制定提供理论依据。
宿主蛋白在病毒感染与复制过程中发挥着重要作用。目前已发现多个抗病毒蛋白质，例如干扰素（IFN）诱导的先天性免疫抑制因子（Myxovirus resistance 2， Mx2）[24]，干扰素（IFN）刺激蛋白Viperin[25]，干扰素诱导的四肽重复序列3 （IFIT3）[26]，胆固醇25-羟化酶（CH25H）[27]等。而有关促进病毒复制的宿主蛋白报道较少见。本研究中，我们发现了宿主蛋白RPL12能够促进PRRSV的复制。RPL12属于核糖体蛋白L11P家族，RPL12基本上通过调控自身的剪接来调控自身的转录，RPL12缺失以密码子特异性的方式影响翻译[28-29]。本研究中，我们发现RPL12能够与GP2b蛋白互作，这可能是其促进PRRSV复制的重要原因之一，而其中的具体机制还有待进一步探索。
GP2b蛋白是一种非糖基化的膜蛋白，其相对分子质量为10 000[30]，被认为参与病毒的侵入[31]和复制[32]。GP2b蛋白在2种类型PRRSV中高度保守且相对大量地存在于病毒粒子中，GP2b与GP3、GP4结合形成病毒粒子表面的异三聚体复合物，在介导宿主细胞免疫、维持病毒糖蛋白间的正确构象及病毒的感染等方面发挥重要的作用[33]。病毒蛋白与宿主蛋白互作的相关研究对于研究PRRSV在细胞内的复制及逃避宿主及宿主抵抗病毒感染的方式都有着非常重要的意义。在细胞水平上研究PRRSV与其宿主蛋白互作的机制有利于寻找更加保守、广谱的靶点。RPL12基因编码核糖体的结构蛋白，并参与蛋白质翻译[34]与蛋白质合成的调节[35]，本研究前期构建了猪肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库，成功地构建了PGBKT7-2b钓饵载体和钓饵菌株，筛选出与GP2b互作的RPL12。本研究中发现宿主蛋白RPL12能够与GP2b互作，并促进PRRSV复制，进一步扩展了GP2b的蛋白质功能。由此可见，GP2b不但在病毒的组装中发挥重要功能，其在病毒和宿主互作过程中也发挥作用。因此，GP2b有可能成为防控PRRSV的靶点之一。
本研究通过免疫共沉淀、激光共聚焦试验发现宿主细胞核糖体蛋白L12 （RPL12）与PRRSV GP2b蛋白之间的相互作用。另外，随着PRRSV的复制，RPL12的转录水平和蛋白质表达水平均明显增强，PRRSV感染能够上调细胞中RPL12的表达。同时，荧光定量和Western-blotting检测发现过表达RPL12能够促进PRRSV的复制，敲减RPL12能够抑制PRRSV的复制。通过上述研究结果扩展了PRRSV GP2b的蛋白质功能，有助于进一步研究PRRSV的感染与复制机制以及与宿主之间的相互作用。
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（責任编辑：陈海霞）