还原型和氧化型谷胱甘肽在化妆品领域的应用比较研究
王婷 郑云云 查建生 童莉
本文简要介绍了还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在化妆品领域应用的联系，以及在清除自由基抗氧化性能和抑制酪氨酸酶美白性能方面的具体差异。
谷胱甘肽（Glutathione）是一种普遍存在于动物、植物和部分细菌体内的抗氧化剂，能够清除活性氧自由基，阻止脂质过氧化，同时帮助代谢过氧化物和重金属，防止有害物质对细胞以及DNA造成损伤，因此被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。
01谷胱甘肽结构上属于三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸构成：首先，由L-谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，这个转化需要谷氨酸-半胱氨酸酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）的参与，这一步反应是谷胱甘肽合成中的限速步骤;其次，被加入的甘氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸的羧基端进一步在谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase）的催化作用下缩合。分子中的半胱氨酸的巯基是谷胱甘肽的主要功能基团。
人体中的谷胱甘肽有两种形式，还原型态（Reduced GSH）和氧化型态（Oxidized GSSG），分别如图1、图2所示。
02还原型的谷胱甘肽和氧化型的谷胱甘肽在细胞中的比例，是测试细胞氧化应激水平的一个重要指标，GSSG与GSH的比值越高表示细胞氧化程度比较高。在正常的细胞和组织中，大于90%的谷胱甘肽都是还原型的，剩下的才是氧化型的谷胱甘肽的二硫化物GSSG。在还原型的状态下，谷胱甘肽中半胱氨酸的巯基是重要的还原基团，是主要起抗氧化作用的基团，而GSSG则在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）的作用下，被转化成还原型的GSH进而才能起到还原和抗氧化的作用：NADPH+GSSG+H2O→2 GSH+NADP++OH-。
金春英等报道过适量的GSSG可协同催化GSH清除1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）自由基，因为GSH和DPPH·发生给电子作用后，本身氧化生成GS·自由基（GSH+DPPH·≒GS·+H++DPPH），由于GS·在水中具有较强的反应活性，因此与水中的GSSG进一步发生氧化还原反应，生成GSH和GS-OH（2GS·+2H2O+GSSG→2GSH+2GS-OH），最终GSSG在谷胱甘肽池中还是依靠转化成GSH起效，但是该研究并未探究单独的GSSG是否对DPPH·自由基具有清除作用。
03目前的化妆品领域，氧化型谷胱甘肽GSSG由于气味相较还原型谷胱甘肽GSH略淡，因而也被广泛使用。但从结构上来说，氧化型的谷胱甘肽中活性基团-硫醇（-SH）已经被转化为二硫键，理论上还原能力应当有所下降，因此有必要比较还原型和氧化型谷胱甘肽在化妆品应用一抗氧化性能方面的区别。可以从对不同自由基的清除作用的角度，定量探讨还原型和氧化型谷胱甘肽清除自由基（抗氧化性能）的差異，且由于谷胱甘肽具备还原能力，而黑色素则是通过一系列酶促氧化反应而形成。因此GSH能在黑色素形成的过程中，还原已经被氧化的多巴醌，转化为谷胱甘肽多巴，进而生成颜色更浅的褐黑素而不是真黑素，如图3所示，从而具备美白效果。因此有必要比较还原型和氧化型谷胱甘肽在美白方面的差异。
04实验
4.1还原型谷胱甘肽（GSSG）和氧化型谷胱甘肽（GSH）对三种不同自由基的清除实验
4.1.1对1，1-二苯基-2-三硝基苯阱（DPPH·）自由基清除实验
实验试剂：还原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、无水乙醇（南京科贝化学技术有限公司，分析纯）、DPPH（北京索莱宝科技有限公司）。仪器耗材：紫外分光光度计、比色皿、移液器、试管、容量瓶、电子分析天平。
试剂配制：准确称取DPPH粉末3mg，用无水乙醇溶解，并定容至50mL容量瓶。
实验步骤：在试管中分别依次加入1mL DPPH溶液和0.5mL不同浓度的待测样品，混匀后于黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准（调零）在517nm波长处测吸光值，吸光值记为A1;空白对照：在试管中分别依次加入1mL无水乙醇和0.5mL不同浓度的待测样品，黑暗处放置60 min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准（调零）在517nm波长处测吸光值，吸光值记为A2;控制组：在试管中加入1mL DPPH溶液和0.5mL无水乙醇，混匀后黑暗处放置60 min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准（调零）在517nm波长处测吸光值，吸光值记为An。根据以下自由基清除率公式计算（K）：K（%）=[1-（A1-A2）/A0]X100%试验重复三次，取其平均值作为最后结果。
4.1.2对羟自由基（HO·）清除实验
实验试剂：还原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索莱宝科技有限公司）、硫酸亚铁铵（国药集团）、邻二氮菲（国药集团）、0.1%双氧水溶液（国药集团）、双蒸水（ddH2O）。
仪器耗材：紫外分光光度计、比色皿、移液器、水浴锅、试管、容量瓶、电子分析天平。
试剂配制：邻二氮菲溶液，用少量乙醇溶解0.148g邻二氮菲，再用双蒸水定容至100mL容量瓶。硫酸亚铁铵溶液，取0.2941g硫酸亚铁铵，用双蒸水定容至100mL容量瓶。
所有试管依次加入表1中的试剂（双氧水最后一步加入），置于37℃水浴反应1h，以1号试管溶液为基准（调零），在536nm波长下分别测定2、3、4、5号试管溶液的吸光度。每次实验做三次平行，结果取平均值。
实验试剂：还原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、邻苯三酚（南京试剂，分析纯）、盐酸（国药集团，分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（国药集团）。
仪器耗材：紫外分光光度计、试管、移液器、比色皿、容量瓶、电子分析天平、水浴锅。
试剂配制：邻苯三酚溶液，准确称取邻苯三酚315.275mg，用10mmol/L HCl溶解，并定容至100 mL棕色容量瓶中。Tris-HCl缓冲液，准确称取Tris 6.057g，蒸馏水溶解后用盐酸调节pH至8.2，定容至1000m L。
实验步骤：取4.5mL Tris-HCl缓;中液于试管中，25℃水浴预热20min后，加入0.5mL不同浓度待测样品和0.5mL邻苯三酚溶液，混匀，25℃水浴反应5min后，立即加入1001μL 8mol/L HCl来终止反应，最后测定反应液在335nm处的吸光度。
式中：An为不加样品（用蒸馏水代替样品）的反应液吸光度;A.为加入样品和邻苯三酚的反应液吸光度;Aj为加入样品，不加邻苯三酚（用蒸馏水代替邻苯三酚）的反应液吸光度。
4.2还原型谷胱甘肽（GSSG）和氧化型谷胱甘肽（GSH）对酪氨酸酶的抑制作用
实验试剂：还原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化实业有限公司）、磷酸缓冲液（Phosphate Buffer，PB）（国药集团）、（蘑菇）酪氨酸酶（生工生物工程上海股份有限公司）、L-左旋多巴（生工生物工程上海股份有限公司）。
仪器耗材：酶标仪（ELx808）、移液器、96孔板、水浴锅、电子分析天平。
试剂配制：L-左旋多巴标准溶液，称取L-左旋多巴9.85mg，溶于10mL的PB中。酪氨酸酶溶液，称取酪氨酸酶1.72mg;，溶于10mL PB中。
用移液器移取40 μL L-左旋多巴标准溶液和80μL的PB缓冲液到96孔板中，分别在待测样品组和样品空白组中加入40μL待测样品，控制组和空白组中加入40μL溶剂，37℃温育10min，最后在待测样品组和样品空白组中加入401aL酪氨酸酶溶液，37℃温育5～10min，迅速在酶标仪490nm下测定吸光度。每个实验做三次平行，取平均值。
酪氨酸酶活性抑制率（%）=（1-Ai/A0）×100%
式中：A0为控制组扣掉空白组的吸光度;Ai：待测样品组扣掉样品空白组的吸光度
05结果与讨论
5.1还原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽对DPPH·自由基的清除率结果
如图4所示，还原型谷胱甘肽GSH清除DPPH·自由基的效果较好，且根据剂量-反应曲线计算可得其半最大效应浓度（EC50）值为0.11 mg/mL，即很低浓度下即可清除DPPH·自由基，表现出一定的氧化性能，当GSH的浓度提高为0.5mg/mL时，其对DPPH·的清除率则提高为95.2%。而由图5可知，氧化型谷胱甘肽GSSG在0.5mg/mL该浓度时，对DPPH·自由基的清除率仅为1.1%，仅为同浓度GSH对自由基清除效率的1.16%。
5.2還原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽对羟自由基（HO·）的清除率结果
由图6可知，还原型谷胱甘肽（GSH）清除羟自由基的效果比较好，根据剂量-反应曲线计算可得其半最大效应浓度（EC50）值为3.5mg/mL，即在比较低的浓度就具备较强的清除HO·自由基抗氧化的能力。当GSH的浓度提高为10mg/mL时，其对羟自由基的清除率也升高至69.0%。而相比之下，由图了可知，氧化型谷胱甘肽（GSSG）即使浓度达到GSH浓度的5倍（50mg/mL），其对羟自由基的清除率也仅为40.3%，可见对于HO·自由基的清除效果而言，GSSG效果不及GSH。
5.3还原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽对超氧阴离子自由基（0_2^-）的清除率结果
由图8所示，当还原型谷胱甘肽（GSH）浓度仅为5mg/mL时，其对O2-自由基的清除率可达89.6%。根据剂量-反应曲线计算可得其半最大效应浓度（EC50）值为0.50mg/mL。而如图9所示，当氧化型谷胱甘肽（GSSG）在同浓度（5mg/mL）条件下，其对超氧阴离子的清除率为0，即使GSSG的浓度为50 mg/mL时，其对超氧阴离子的清除率也仅有43.3%，远不及GSH的清除效率。
5.4还原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽对酪氨酸酶的抑制效果
由图10可知，1.00mg/mL的还原型的谷胱甘肽（GSH）对酪氨酸酶活性抑制率可以达到92.5%，并且根据剂量-反应曲线计算可得，半最大抑制浓度（IC50）值为0.32 mg/mL。即极低浓度则可有效抑制酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成。而如图11所示，100mg/mL的氧化型谷胱甘肽（GSSG）对酪氨酸酶活性抑制率可以达到88.3%，即100倍于GSH的浓度（1mg/mL）也达不到GSH对酪氨酸92.5%抑制率的水平，而根据剂量-反应曲线计算可得，氧化型谷胱甘肽GSSG对酪氨酸酶的半最大抑制浓度（IC50）值为57.2mg/mL，约是还原型谷胱甘肽（GSH）IC50值的178倍，即GSSG通过抑制酪氨酸酶的活性从而抑制黑色素生成的能力是远不及GSH的。
06结论
氧化型GSSG和还原型谷胱甘肽GSH在化妆品中均因其抗氧化清除自由基和抑制酪氨酸酶和黑色素生成的功效而被广泛使用，且因为在氧化型谷胱甘肽GSSG中因为有特征气味的巯基键转化为二硫键，特征气味变淡，而更为配方师和消费者接受，或者将GSH和GSSG二者按照一定比例混合使用。但从清除DPPH自由基、HO·自由基、O2-自由基的体外实验结果来看，GSH的活性和功效性更加突出。同浓度（0.5mg/mL）下，清除DPPH自由基的抗氧化性能至少为GSSG的86倍，同浓度（10.0mg/mL）下，清除HO·自由基的抗氧化性能至少为GSSG的2倍，在同浓度（5mg/mL）条件下，清除O2-自由基的清除率GSH为89.6%，而GSSG为0%，由此可见，当两分子还原型谷胱甘肽通过二硫键结合为一分子GSSG后，因为强还原基团-SH的消失，其抗氧化性能大大降低。而根据抑制酪氨酸酶（抑制黑色素生成）活性（IC50）体外实验结果来看，GSH至少为GSSG的178倍，因为还原性/抗氧化性能的下降，进一步影响了黑色素生成过程中的酶促氧化反应，从而美白效果也下降。
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