莲子心饮片含量测定方法优化
闫悦欣 梁思怡 纪胜男 李丽丽 哈婧
摘要：為了解决提取效率低而导致的市售莲子心含量项鲜有合格的问题，对莲子心饮片中有效成分的提取方法进行优化。分别对莲心碱的提取方式、提取溶剂以及提取溶剂体积进行了考察，利用优化后的提取方法制备莲子心饮片供试品溶液，选用Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm）色谱柱，以乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸钠溶液-冰醋酸（体积比55∶44∶1）为流动相，在流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为284 nm，进样量为10 μL条件下，进行含量测定。结果表明，最佳的提取条件为选择25 mL 0.08%盐酸甲醇溶液作为提取溶剂，超声提取40 min;优化后的提取方法使莲心碱的含量测定较稳定，莲心碱的提取效率得到显著的提升;莲心碱进样量在36.9 ～ 369.5 ng时，线性关系良好，平均回收率为99.9%，RSD为1.79%。优化后的提取方法操作简便，提取率高，重复性好，方法准确，可为莲心碱的提取以及后续莲子心饮片质量标准的制定提供参考依据。
关键词：色谱分析;莲子心饮片;莲心碱;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号：O657.7+2文献标识码：ADOI：10.7535/hbgykj.2021yx04008
Optimization of the determination method of
Nelumbinis Plumula decoction pieces
YAN Yuexin1， LIANG Siyi1， JI Shengnan1， LI Lili2， HA Jing1
（1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China; 2. Hebei Yuzhilin Pharmaceutical Company Limited， Xingtai， Hebei 054400， China）
Abstract：
In order to solve the problem of the low qualification rate of content detemination items of commercial Nelumbinis Plumula decoction pieces causing by the low extraction effciency of active ingredients，the extraction method of liensinine in Nelumbinis Plumula decoction pieces was optimized. The extraction method of liensinine， the extraction solvent， and the volume of the extraction solvent were investigated respectively， and the test solution of the Nelumbinis Plumula decoction pieces was prepared by using the optimized extraction method. The method was performed on Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm× 150 mm ） column with acetonitrile-0.05 mol/L sodium docecylsulfonate solution-glacial acetic acid （volume ratio 55∶44∶1） as the mobile phase. The content of liensinine in the Nelumbinis Plumula decoction pieces was determined under the conditions of the flow rate of 1.0 mL/min， the column temperature of 30 °C， the detection wavelength of 284 nm， and the injection volume of 10 μL. The results show that the best extraction conditions are 25 mL of 0.08% hydrochloric acid methanol solution as the extraction solvent， and ultrasonic extraction for 40 minutes. The optimized extraction method makes the content determination of liensinine more stable， and the extraction efficiency of liensinine is significantly improved. The liensinine has a good linear relationship in the injection range of 36.9 ～ 369.5 ng. The average recovery rate is 99.9%， and the RSD is 1.79%. The method is simple and accurate with the good reproducibility and high extraction rate， which can provide a reference for the extraction of liensinine and the formulation of the quality standards of Nelumbinis Plumula decoction pieces.
Keywords：chromatographic analysis; Nelumbinis Plumula decoction pieces; liensinine; content determination; high performance liquid chromatography（HPLC）
莲子心为睡莲科植物莲（Nelumbinis nucifera Gaertn.）成熟种子中的干燥幼叶及胚根[1]。莲子心中含有生物碱类、黄酮类等多种化学成分，具有抗氧化、降血糖、保护心血管、促进脂肪分解等药理活性[2-8]。莲子心在中国资源丰富，主产于福建、湖南、江苏等地[9-12]。采用《中华人民共和国药典（2015年版 一部）》（以下简称《中国药典》）莲子心含量测定项下的方法，测定莲子心饮片，市售饮片鲜有合格品，导致中药临床和制剂生产几乎无莲子心可用[13-15]。根据研究报道，多数莲子心中莲心碱含量达不到标准，可能是由于莲心碱提取效率不够高，但现有改进的莲子心提取方法，其含量测定结果并不满意[15]。本文通过考察合适的提取方式、提取溶剂以及提取溶剂体积，对《中国药典》莲子心含量测定项下方法中的提取方法进行优化，提高饮片中莲心碱的提取率。第4期闫悦欣，等：莲子心饮片含量测定方法优化河北工业科技第38卷
1仪器、药品及试剂
1.1主要仪器
LC-10ATvp高效液相色谱仪，日本DHIMADZU公司提供;SQP十万分之一电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司提供;DZKW-S-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司提供;KQ-250B超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司提供;FZ102万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司提供。
1.2试剂及药品
莲心碱高氯酸盐对照品 （批号为111696-201703，纯度≥96.3%，中国食品药品检定研究院提供），甲醇、乙腈 （色谱纯，Sunrise Chem公司提供），十二烷基磺酸钠、冰醋酸 （分析纯，天津市永大化学试剂有限公司提供），莲子心饮片 （样品1产自中国浙江，样品2产自中国福建，样品3产自中国广东，样品4产自中国湖南，样品5产自中国江苏，样品6产自中国湖北）。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm），流動相为乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸钠溶液-冰醋酸（体积比为55∶44∶1），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为284 nm，进样量为10 μL。
2.2对照品溶液的制备
取莲心碱高氯酸盐对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液 （莲心碱质量=莲心碱高氯酸盐质量/1.358 7）。
2.3供试品溶液的制备考察
2.3.1提取方式的比较
《中国药典》中莲子心含量测定项下的提取方法：以2%（体积分数，下同）盐酸甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流30 min。本试验设定提取溶剂为2%盐酸甲醇溶液，对水浴回流和超声处理 （功率为250 W，频率为40 kHz） 这2种方式的提取效果进行比较。
称取样品约0.5 g （过4号筛），精密称定，平行6组，每组2份，加入2%盐酸甲醇溶液25 mL，每组设定不同时间，分别用水浴回流、超声处理 （功率为250 W，频率为40 kHz） 提取样品，然后放冷，称重，补重，摇匀，滤过，精密取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，根据“2.1”项下的色谱条件，测定。结果2种方式提取出莲心碱的含量接近，综合莲心碱的提取效率及提取时间，确定提取方式为超声处理40 min，见表1（所用样品为样品4，产自中国湖南）。
2.3.2不同盐酸含量的提取溶剂对莲心碱提取效率的影响
精密取样品约0.5 g （过4号筛），平行11组，每组2份，分别加入纯甲醇和不同盐酸含量的盐酸甲醇溶液 （4%，2%，1%，0.8%，0.5%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08%，0.07%）各25 mL，称定重量，超声处理40 min （功率为250 W，频率为40 kHz），放冷，再称定重量，补重，摇匀，滤过，其余试验内容按“2.3.1”项下步骤进行。
由含量测定结果可知，莲心碱的提取效率与提取溶剂中盐酸的含量有关，当盐酸含量从4%逐渐降低至0.08%时，莲心碱的含量逐渐升高，同时色谱图的分离度也明显改善，当盐酸含量为0.07%时，莲心碱的含量不再升高，当提取溶剂为纯甲醇时，莲心碱的含量降低。因此，适当降低提取溶剂中盐酸的含量，有利于莲心碱的提取以及色谱图峰形的改善，含量测定结果及色谱图见图1和图2。
2.3.3提取溶剂体积的考察
称取样品约0.5 g （过4号筛），精密称定，平行3组，每组2份，分别加入不同体积 （15，25，40 mL） 0.08%盐酸甲醇溶液，称重，超声处理40 min （功率为250 W，频率为40 kHz），冷却，称定重量，补重，摇匀，滤过，其余试验内容按“2.3.1”项下步骤进行。由试验结果可知，当提取溶剂的体积为25 mL时，莲子心饮片中莲心碱提取率达到最高并且稳定，结果见表2。
2.3.4供试品溶液的制备
通过优化莲子心饮片的提取条件，确定供试品溶液的制备方法：取样品约0.5 g （过4号筛），加入0.08%盐酸甲醇溶液25 mL，称定重量，超声处理40 min （功率为250 W，频率为40 kHz），放冷，称重，用0.08%盐酸甲醇溶液补重，摇匀，滤过，精密取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4专属性试验
以0.08%盐酸甲醇溶液为空白溶液，进行专属性试验，根据“2.1”项下的色谱条件，测定。结果说明空白溶液对莲心碱的含量测定无干扰，见图3。
2.5线性关系
按照“2.2”项下步骤制备对照品溶液，分别取对照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。结果莲心碱进样量为36.9 ～ 369.5 ng，线性关系良好，线性回归方程为y=945.13x-67.854，R2=0.999 9，见图4。
2.6精密度试验
按照“2.2”项下步骤制备对照品溶液，取对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果显示RSD为0.75% （n=6），表明仪器精密度良好，结果见表3。
2.7稳定性试验
根据“2.3.4”项下供试品溶液的制备方法，取莲子心饮片，制备样品溶液，每隔一定时间，进行测定。结果在24 h范围内，峰面积的稳定性较好，RSD为0.32%，结果见表4。
2.8重复性试验
按照“2.3.4”项下供试品溶液的制备方法，取莲子心饮片，平行制备6份样品溶液，测定。结果样品中莲心碱的平均含量（质量分数，下同）为0.984 0 mg/g，RSD为0.39%，说明方法重现性较好，结果见表5。
2.9回收率试验
精密称取9份莲子心饮片粉末，分别加入3种不同浓度的莲心碱高氯酸盐对照品溶液，每个浓度平行3份，各浓度对照品加入量与所取供试品含有量之比分别为0.5∶1，1∶1，1.5∶1。根据“2.3.4”项下供试品溶液的制备方法，制备样品溶液，测定。结果加样回收率的平均值为99.9%，RSD为1.79%，方法准确度较高，结果见表6。
2.10样品含量测定
本实验采用3种提取方法 （分别为《中国药典》标准方法（简称药典标准方法），文献[14]中的方法（简称文献方法），以及前述“2.3.4”项下供试品溶液的制备方法（简称改进后的方法），分别对不同产地的莲子心样品进行提取，然后根据不同方法下的色谱条件，分别进行含量测定。结果表明，改进后的方法使部分莲子心饮片达到《中国药典》中规定的含量限度，且该方法提取出莲心碱的量高于药典标准方法2.12倍，是文献方法的1.25倍。因此说明，改进后的方法使莲心碱的提取率得到一定程度的提升，见表7。
3讨论
1）色谱条件的讨论
为了更方便地将样品续滤液被流动相稀释，在药典方法的基础上，调整流动相的比例为乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸钠溶液-冰醋酸（55∶44∶1），同时色谱图峰形保持良好。十二烷基磺酸钠易溶于热水，因此在流动相配制过程中，将十二烷基磺酸钠置于热水（50 ℃ ）中溶解，制成0.015 mol/L的十二烷基磺酸钠溶液，冷却后观察发现，当所处环境温度低于30 ℃时，十二烷基磺酸钠在水中易产生析出现象，因此建议在使用该流动相时，要注意严格控制室内的温度，且确保柱温不低于30 ℃。
2）提取方法原因分析
采用水浴回流、超声的提取方式，分别对莲子心饮片进行提取，结果2种方式提取出莲心碱的含量接近，从莲心碱的提取效率及提取时间考虑，最终选择提取方式为超声提取40 min。莲心碱易溶于甲醇，选择甲醇为提取溶剂，同时莲心碱又是一种双苄基四氢异喹啉生物碱，加入适量的盐酸，能够提高提取效率。经试验条件筛选，当提取溶剂为0.08%的盐酸甲醇溶液时，莲心碱的提取效率最高。
3）莲子心质量标准的评价指标
莲子心主要活性成分为生物碱类，其中莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱在总生物碱中占据较大比重，并且这3种生物碱都具有明确的药理活性[16-24]。经上述研究发现，改进后的方法使莲子心饮片中莲心碱的提取率得到显著的提升，但仍有一部分饮片未能达到《中国药典》中莲子心项下规定的含量限度，因此仅以莲心碱作为莲子心饮片的评价指标，对于饮片的质量评价是较片面的，在后续莲子心饮片质量标准的制订中，建议将莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱的含量作为莲子心饮片质量评价的指标，从而使莲子心饮片得到更全面的评价。
4结语
采用《中国药典》莲子心含量测定项下的方法，测定市售莲子心饮片时，几乎没有合格品，因此以优化含量测定项下供试品溶液的提取过程为研究方向，通过筛选供试品的提取方法、提取溶剂以及提取溶剂体积，确定了莲子心饮片的最佳提取条件，对《中国药典》中莲子心含量测定项下的方法进行了优化。采用优化后的供试品溶液制备方法，对莲子心饮片进行提取，根据调整后的色谱条件进行测定，结果优化后的方法使莲心碱的提取率得到显著提升，但仍有部分饮片未达到《中国药典》莲子心项下的含量限度。查阅相关资料，得知《中国药典》中莲子心项下制定莲心碱合格指标过高，市售饮片鲜有合格品。因此在后续对莲子心饮片进行含量测定时，建议测定莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱的总量，以期使多数莲子心饮片能够符合药用要求。
参考文献/References：
[1]國家药典委员会.中华人民共和国药典（2015版 一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]赵秀玲，党亚丽.莲子心化学成分及其提取、药理作用的研究进展[J].食品科学，2018，39（23）：329-336.
ZHAO Xiuling，DANG Yali. Recent advances in chemical components，extraction and pharmacological effects of Nelumbinis Plumula[J].Food Science，2018，39（23）：329-336.
[3]张庆贺.槐角和莲子心化学成分及生物活性的研究[D].长春：吉林大学，2018.
ZHANG Qinghe.Studies on the Chemical Constituents and Biological Activities of Fructus Sophorae and Nelumbinis Plumula[D].Changchun：Jilin University，2018.
[4]孙婵.莲子心化学成分及甲基莲心碱纯化工艺研究[D].沈阳：辽宁大学，2016.
SUN Chan.Researches on Chemical Constituents in Lotus Plumule and Purification Process of Neferine[D].Shenyang：Liaoning University，2016.
[5]施繼尧，王蒙，吴弢.莲子心的化学成分及生物活性研究进展[J].中医药导报，2018，24（21）：105-108.
SHI Jiyao，WANG Meng，WU Tao. Research progress of chemical constituents and biological activities of Lianzixin （Nelumbinis Plumula）[J].Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2018，24（21）：105-108.
[6]田文月.莲子心总黄酮、总生物碱化学成分及体内外活性研究[D].广州：广东工业大学，2019.
TIAN Wenyue.Study on Constituents and Activities in Vitro and Vivo of Total Flavonoids and Alkaloids from Plumula Nelumbinis[D].Guangzhou：Guangdong University of Technology，2019.
[7]李希珍.莲子心化学成分及生物活性的研究[D].长春：吉林大学，2016.
LI Xizhen. Studies on the Chem ical Constituents and Bio-activities of Nelumbinis Plumula[D].Changchun：Jilin University，2016.
[8]孙振宇.鼎湖血桐和莲子心化学成分及生物活性研究[D].昆明：云南大学，2019.
SUN Zhenyu.Studies on Chemical Constituents and Bioactivities of Macaranga Samponii Hance and Nelumbinis Plumula[D].Kunming：Yunnan University，2019.
[9]姜涛，施枝江，陈林明，等.ICP-MS法测定不同产地莲子及莲子不同部位中5种重金属元素含量[J].亚太传统医药，2018，14（10）：55-58.
JIANG Tao，SHI Zhijiang，CHEN Linming，et al.Determination of 5 heavy metal elements in lotus seed of different cultivations and parts by ICP-MS[J].Asia-Pacific Traditional Medicine，2018，14（10）：55-58.
[10]王晓颖，连赟芳，褚克丹，等.HPLC测定建莲莲子心生物碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（22）：117-120.
WANG Xiaoying，LIAN Yunfang，CHU Kedan，et al.Determination of alkaloids in Nelumbinis Plumula from Fujian province by HPLC[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2012，18（22）：117-120.
[11]寿国香，刘冰，周立红，等.离子对反相HPLC法测定10个产地莲子心中莲心碱的含量[J].中草药，2001，32（11）：989-990.
SHOU Guoxiang，LIU Bing，ZHOU Lihong，et al.Determination of liensinie in seed of Nelumbo Nucifera by ion pair RP-HPLC[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2001，32（11）：989-990.
[12]王珊，时伟朋，田文月，等.莲子心HPLC指纹图谱研究及不同产地生物碱含量测定[J].中华中医药学刊，2018，36（6）：1454-1457.
WANG Shan，SHI Weipeng，TIAN Wenyue，et al.Study on HPLC fingerprint of Plumula Nelumbinis and content determination of alkaloids from different habitats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2018，36（6）：1454-1457.
[13]吴梅青，李俊雅，陈丹.莲子心中有效成分与微量元素含量的相关性研究[J].海峡药学，2019，31（4）：31-33.
WU Meiqing，LI Junya，CHEN Dan.Study on the correlation between trace elements and the active ingredient in Plumula Nelumbinis[J].Strait Pharmaceutical Journal，2019，31（4）：31-33.
[14]石炳娟，荆汉卫.对《中国药典》2015年版一部莲子心含量测定方法的改进[J].中国药品标准，2018，19（4）：245-251.
SHI Bingjuan，JING Hanwei.Improvement of the determination method of Plumula Nelumbinis in Vol I ChP 2015[J].Drug Standards of China，2018，19（4）：245-251.
[15]史利瑶，李建晨，田蜜.少腹逐瘀丸质控方法研究[J].河北科技大学学报，2019，40（3）：208-214.
SHI Liyao，LI Jianchen，TIAN Mi.Study on quality control methods of Shaofu Zhuyu pills[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（3）：208-214.
[16]SHEN Yitong，BIAN Rui，LI Yaxiong，et al.Liensinine induces gallbladder cancer apoptosis and G2/M arrest by inhibiting ZFX-induced PI3K/AKT pathway[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2019，51（6）：607-614.
[17]劉贝贝，陈微微，张雯婧，等.异莲心碱对小鼠离体气管平滑肌的舒张作用[J].中国病理生理杂志，2019，35（5）：920-925.
LIU Beibei，CHEN Weiwei，ZHANG Wenjing，et al.Relaxation effect of isoliensinine on isolated mouse airway smooth muscle[J].Chinese Journal of Pathophysiology，2019，35（5）：920-925.
[18]李琴，商晶.甲基莲心碱的药理作用研究进展[J].海峡药学，2012，24（1）：37-39.
[19]李琦玮，张甘霖，孙旭，等.甲基莲心碱抗肿瘤药理作用及其分子机制研究进展[J].中国药房，2019，30（8）：1134-1138.
[20]孟雪莲，陈曼玲，陈长兰.莲子心生物碱活性成分的药理作用研究进展[J].辽宁大学学报（自然科学版），2019，46（3）：229-236.
MENG Xuelian，CHEN Manling，CHEN Changlan.Research progress in pharmacological effects of alkaloids from Lotus Plumule[J].Journal of Liaoning University（Natural Science Edition），2019，46（3）：229-236.
[21]YANG Xinzhou，HUANG Mi，YANG Jie，et al. Activity of isoliensinine in improving the symptoms of type 2 diabetic mice via activation of AMP-activated kinase and regulation of PPARγ[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2017，65（33）：7168-7178.
[22]LI Huihui，CHEN Wenhang，CHEN Yusa，et al.Neferine attenuates acute kidney injury by inhibiting NF-κB signaling and upregulating Klotho expression[J].Frontiers in Pharmacology，2019，10：1197.
[23]傅丽媛，陆平成，潘扬.莲心碱高氯酸盐对小鼠腹腔巨噬细胞的作用[J].南京中医药大学学报，1999，15（4）：222-223.
[24]张翔，宋金春.异莲心碱的药理作用研究进展[J].医学综述，2016，22（19）：3846-3849.
ZHANG Xiang，SONG Jinchun.Research advances in the pharmacological effects of isoliensinine[J].Medical Recapitulate，2016，22（19）：3846-3849.
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