HS-SPME-GC-MS在鲜牡蛎挥发性成分分析的应用
陆大鹏 蔡秋萍
摘 要：目的：建立一种提取鲜牡蛎挥发性成分的分析方法，为牡蛎的应用及深加工提供依据。方法：使用顶空固相微萃取法提取鲜牡蛎挥发性成分，并对提取参数和仪器参数进行优化。结果：顶空固相微萃取法对牡蛎样品提取的最佳条件为使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS规格的萃取头，在60 ℃下对2.5 g的牡蛎样品萃取60 min;解吸温度为200 ℃。结论：优化后的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法能较好地提取鲜牡蛎中挥发性成分，此研究为提高牡蛎的市场价值和使用价值提供理论依据。
关键词：牡蛎;挥发性成分;固相微萃取-气相色谱-质谱联用
Application of HS-SPME-GC-MS in the Analysis of Volatile Components in Fresh Oysters
LU Dapeng， CAI Qiuping
（Zhanjiang Food and Drug Inspection Institute， Zhanjiang 524000， China）
Abstract：
Objective：
To establish an analytical method for extraction volatile components from fresh oysters ，so as toprovide a basis for the application and further processing of oysters. Method：
The volatile components of fresh oysters were extracted by headspace solid-phase microextraction， and the extraction parameters and instrument parameters were optimized. Result：
The optimal conditions for the extraction of oyster samples by headspace solid-phase microextraction were to extract 2.5 g of oyster samples at 60 ℃ for 60 min using a 50/30 μm DVB/CAR/PDMS extraction head; the desorption temperature was 200 ℃. Conclusion：
The optimized headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry method can better extract the volatile components in fresh oysters. This study provides a theoretical basis for improving the market value and use value of oysters.
Keywords：
oyster; volatile components; headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry
固相微萃取（Solid-phase Microextraction，SPME）
法已被广泛用于萃取食品中的挥发性成分[1]。根据该方法的工作原理，通常认为对试验结果影响较大的萃取参数是萃取涂层、萃取温度、萃取时间等[2-3]。同时，气相色谱（Gas Chromatography，GC）仪器端的条件也直接影响着分析的效果和萃取涂层的使用寿命，大多数学者采用两段升温程序进行分离，分离化合物较聚集[4-5]。为获得更优的SPME的萃取效果及分析效果，需对SPME的萃取参数和解吸分析参数进行优化。本文以鲜牡蛎为试验材料，建立牡蛎挥发性成分的分析方法，通过研究顶空固相微萃取（Headspace Solid-phase Microextraction，HS-SPME）萃取效果的主要影响因素及优化GC的仪器使用条件，建立萃取效率高、分析结果准确的分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料
近江牡蛎（Ostrea rivularis），2021年1月购于湛江市霞山区上坡塘综合市场，平均重约20.10 g，长约6.0 cm，去壳，洗净，沥干，备用。
1.2 仪器与设备
恒温水浴振荡器（SHZ-A，上海跃进医疗器械有限公司）;电子天平（Qumintix 224-1CN，赛多利斯科学有限公司）;手动固相微萃取装置（美国Supelco公司）;萃取纤维头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS，美国Supelco公司）;多样品均质系统（GHS-66北京莱伯泰科仪器股份有限公司）;凝胶色谱-气质联用仪（GPC/GCMS-QP2010，日本岛津）;分析天平（ME203E梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 鮮牡蛎预处理
开壳取鲜牡蛎肉，牡蛎肉洗净泥沙后匀浆，备用。
1.3.2 HS-SPME萃取方法
准确称取一定量的牡蛎匀浆液置于20 mL的顶空瓶中密封，萃取头在首次使用时需250 ℃条件下老化1 h。将老化好的固相微萃取针插入样品瓶中大约1 cm处，推出萃取头（不要接触到样品，以免污染萃取头），在设定的温度下顶空吸附预设时间，收回萃取头后，拔出萃取装置，迅速插入气相进样口，在250 ℃条件下解吸60 min。
1.3.3 仪器条件
（1）气相色谱条件。毛细管色谱柱HP-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm，5%苯基/95%聚二甲基硅氧烷），载气为高纯氦气（99.999%），流速为1.0 mL/min;不分流进样，进样口温度为250 ℃;柱温：初始温度40 ℃，恒温1 min，以3 ℃/min的速率升到100 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min的速率升到150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升高到250 ℃，保持5 min。
（2）質谱条件。电离方式：电子轰击EI;离子源温度：200 ℃;接口温度：250 ℃;扫描模式：全扫描;扫描质子范围：35～500 m/z;EI电子能量：70 eV。各组分经过NIST17.0标准普库检索匹配。
1.3.4 萃取和解吸条件参数的优化
SPME法提取牡蛎中的挥发性成分的影响因素有萃取头、萃取温度、萃取时间、样品量和解吸温度，按照1.3.2和1.3.3的操作方法和仪器条件，通过试验优化以上条件参数，确定合适的萃取头和最佳的萃取温度、时间、样品量及解吸温度。
（1）萃取头的选择。准确称取样品2 g，选用4种不同规格萃取头，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS进行加热萃取，萃取温度为60 ℃，萃取时间为50 min，进行气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）上机分析。
（2）萃取温度的选择。准确称取样品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取头，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃温度下萃取40 min，进行GC-MS上机分析。
（3）萃取时间的选择。准确称取样品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取头，萃取温度为60 ℃，萃取时间分别为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，然后上机解吸分析，进行GC-MS上机分析。
（4）称样量的选择。分别称取牡蛎样品1 g、2 g、3 g、4 g、5 g和6 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取头，萃取温度为60 ℃，萃取40 min，进行GC-MS上机分析。
（5）解吸温度的选择。准确称取样品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取头，萃取温度为60 ℃，萃取40 min，设置进样口温度分别为150 ℃、200 ℃、250 ℃和300 ℃解吸，进行GC-MS上机分析。
2 结果与分析
2.1 萃取头的确定
萃取头的萃取材料及涂层厚度对分析物的固相吸附量和平衡时间都有影响[6]。应综合以上因素选择合适的涂层材料和厚度，萃取头的优化试验结果见图1。4种萃取头中，萃取牡蛎中的挥发性成分总峰面积较大的萃取头规格是75 μm CAR/PDMS和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取总峰面积最小的是100 μm PDMS规格萃取头。虽然理论上膜厚度大的萃取头吸附容量大，但试验结果表明吸附容量大不代表萃取得到的总峰面积大，原因是牡蛎中的挥发性成分复杂，萃取头的固定相具有选择性，100 μm PDMS规格萃取头是单一的固定相，不适合用于萃取牡蛎中的挥发性成分。
仅从总峰面积评价萃取头的吸附效果不全面，总峰面积能表明萃取头吸附较充分，但可能是对牡蛎中的一种挥发性成分或其中的几种成分有强吸附作用，吸附的挥发性成分种类可能不全。因此，需评价峰数量指标。萃取峰数量最多的萃取头规格为50/30 μm DVB/CAR/PDMS，其次是规格为65 μm PDMS/DVB的萃取头，峰数量越多表明吸附的挥发性成分种类越多，吸附的挥发性成分数量与萃取头的固定相有关，规格为50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取头为3种复合固定相，比另外3种规格的固定相复合度高，用该规格萃取头萃取牡蛎中的挥发性成分峰数量最多。结合总峰面积和峰数量综合评价萃取头，适合萃取牡蛎中挥发性成分的萃取头规格为50/30 μm DVB/CAR/PDMS。
2.2 萃取温度的确定
萃取温度是影响反应速率的重要因素，选取合适的萃取温度，有利于萃取牡蛎中的挥发性成分。萃取温度的优化试验结果见图2。用萃取头规格为50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取牡蛎中的挥发性成分，萃取的总峰面积随萃取温度的升高整体呈先增加后减少的趋势，在70 ℃达到顶峰值;峰数量随温度的升高呈先增加后减少再增加的趋势。在热作用下，分子间的热运动随温度的升高越来越激烈，当挥发性成分和涂层固定相间的分配系数达到最高，萃取效果达到最高水平，且温度继续升高，热运动加剧，导致分配系数减少，萃取量反而减少，因此70 ℃的总峰面积比80 ℃大。此外，温度过高易导致基质中化合物发生化学变化，从而导致挥发性成分发生变化，不利于样品真实成分的检测。因此，需选取萃取效果较佳且尽量保持样品真实性的的萃取温度，综合考虑，确定60 ℃为较佳萃取温度。
2.3 萃取时间的确定
萃取时间主要是指萃取达到或接近平衡所需要的时间，长时间的温热条件下，可能产生不利的影响，如微生物的反应、化合物间的反应等[7]。因此，试验需选取合适的萃取时间，萃取时间的优化试验结果如图3。
在同等萃取条件下，萃取的总峰面积和峰数量在60 min时达到最高，之后萃取的总峰面积和峰数量出现小幅度的先下降后升高的变化。在萃取开始时，萃取头中固定相中物质的量增加较快，当接近萃取平衡时，萃取的速度下降。但随着萃取时间的延长，加热可能会促进基质中化合物的反应，导致挥发性成分发生变化，萃取涂层的分配系数发生变化，因此70 min和80 min时的萃取效果不一致。为保证样品的稳定性和试验结果具有良好的萃取效果，综合考虑，确定60 min为较佳萃取时间。
2.4 称样量的确定
称样量对萃取效果产生的影响主要来源于样品量对顶空体积的影响，样品量间接影响样品的萃取效果，因此选取合适的称样量有利于提升萃取的效果。称样量的优化试验结果见图4。总峰面积的整体结果呈先上升后下降的趋势。样品量对萃取效果的影響明显，样品量太少时，几乎无法萃取到样品中的挥发性成分。此外，顶空体积的变化对萃取效果有一定的影响，样品量大于1 g时，挥发性成分的总峰面积整体呈先上升后下降的趋势，但峰数量总体呈下降趋势，样品量增多的同时，顶空体积减少，顶空基质的压力升高，导致某些挥发性成分的萃取分配系数增大，同时部分物质萃取分配系数降低，导致萃取的物质数量与物质的量不同步。因此，为获得更多挥发性成分的信息，应以峰数量为指标，同时参考总峰面积选取最佳样品量。综合考虑，样品量为2 g和3 g时，牡蛎萃取效果较好，因此确定2.5 g为较佳样品称样量。
2.5 解吸温度的确定
解吸温度为气相进样口的温度，其决定样品是否能被全部气化解吸进样，从而影响样品分析的结果。温度过高会导致易分解组分分解，分析结果出现失真情况。因此，须选择合适的进样口分析温度，进样口温度的优化试验结果见图5和图6。
含硅化合物的峰数量进样口温度对化合物的分析效果影响较大。总峰面积随进样口温度的上升呈先上升后下降的趋势，但化合物的峰数量一直呈增加的趋势。在150 ℃和200 ℃时，牡蛎中的挥发性成分呈递增趋势被解析进行分析。但250 ℃时，分析的化合物的总峰面积下降，300 ℃时更低，但此时的峰数量仍在增加，可能是由于高于250 ℃热解吸下的化合物被分解，进样口温度过高导致化合物气化残留在进样口周围未能进入色谱柱检测。因此，对牡蛎中挥发性成分的分析检测，进样口的温度不是越高越好，合适的进样口温度能保证结果分析的有效性。此外，试验中发现解吸过程中，分析物中含硅化合物的含量增多，高温加热后，会将萃取头涂层中的含硅固定相热解吸下来，影响萃取头的使用寿命。
图6的结果显示，含硅化合物峰面积的比例和含硅化合物的峰数量随进样口温度的升高而升高，且两者增幅趋势几乎同步。高温热解吸对固相微萃取头同样也有解吸作用，过高温度下萃取头上的固定材料气化的量增多，从而缩短该固相萃取头的使用寿命，甚至会影响该萃取头下一次萃取的效果。综上所述，200 ℃下，牡蛎的挥发性成分的分析结果较为真实有效，且此温度下对固相微萃取头的使用寿命较为友好，因此选取进样口为200 ℃为GC进样口解吸温度。
3 结论
顶空固相微萃取的萃取条件对萃取效果有明显的影响，通过优化萃取头、萃取温度、萃取时间、样品量和解吸温度参数，得到HS-SPME对牡蛎样品萃取的最佳萃取参数为50/30 μm DVB/CAR/PDMS规格的萃取头，牡蛎样品称样量为2.5 g，萃取温度60 ℃，萃取时间为60 min，解吸温度为200 ℃。此研究为提高鲜牡蛎的市场价值、使用价值提供理论依据。
参考文献
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作者简介：陆大鹏（1994—），男，广东湛江人，硕士，助理工程师。研究方向：食品安全。
蔡秋萍（1993—），女，广东佛山人，硕士。研究方向：食品检测。
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