瓜列当致病真菌的鉴定及其发酵产物活性研究
罗文芳 何伟 孙晓军 周军辉 许建军
摘要 为筛选对瓜列当具有良好防治效果的生防真菌，本研究从新疆加工番茄田自然发病的瓜列当茎基部分离病原真菌，采用盆栽瓜列当接种无菌发酵滤液原液，筛选对瓜列当具有强致病性的菌株;采用共培养法测定菌株不同浓度无菌发酵滤液及其发酵产物萃取物对瓜列当种子萌发的影响;利用形态学特征和分子生物学方法对其进行种类鉴定。结果表明：盆栽瓜列当接种无菌发酵滤液原液可使瓜列当植株伤口变褐，严重的可造成整株萎蔫死亡;菌株JTF001发酵原液对瓜列当种子萌发抑制率可达100%，25倍、50倍稀释液抑制率分别为92.88%和87.62%;浓度为5 μg/mL和1 μg/mL JTF001发酵产物对瓜列当种子萌发抑制率均达100%;浓度为0.5、0.25 μg/mL 和0.1 μg/mL 的JTF001发酵产物对瓜列当种子萌发的抑制率分别为91.03%、81.87%和60.04%;结合形态学和基于rpb2、tef 1和gapdh基因序列分析，将菌株JTF001鉴定为交链格孢Alternaria alternata。上述结果表明菌株JTF001有作为开发防治瓜列当生物农药的潜力。
关键词 瓜列当;交链格孢;生物防治;发酵产物
中图分类号：
S476;S451
文献标识码：
A
DOI：
10.16688/j.zwbh.2021192
Abstract The present study was to isolate fungi from the stem base of Orobanche aegyptiaca， which naturally occurred in processing tomato fields in Xinjiang， and screen the strong pathogenic strains against O.aegyptiaca by potting assay with the sterile fermentation filtrate of the strains stock solution. The activities of the sterile fermentation filtrate of the strains and extracts of its solid fermentation products against the seed germination of O.aegyptiaca were measured by using the co-cultivation method. The species of strong pathogenic strains were identified by using morphological characteristics and molecular biological method. The potting assay showed that the inoculated area turn brown after inoculation with the sterile fermentation filtrate， and the whole plant even wilted or died. The inhibition rate of the fermentation filtrate of strain JTF001 on the seed germination of O.aegyptiaca was 100%， and the 25-fold and 50-fold dilutions was 92.88% and 87.62%， respectively. The inhibition rate of the extracts of the solid fermentation products on seed germination of O.aegyptiaca was up to 100% at the concentration of 5 μg/mL or 1 μg/mL， and it was 91.03%， 81.87% and 60.04% at 0.5 μg/mL， 0.25 μg/mL or 0.1 μg/mL， respectively. Strain JTF001 was identified as Alternaria alternata based on morphological characteristics and sequence analysis of rpb2， tef 1 and gapdh. In conclusion， the above results suggested that A. alternata JTF001 had the potential to be developed as a biopesticide for the prevention of O.aegyptiaca.
Key words Orobanche aegyptiaca;Alternaria alternata;biocontrol;fermented products
瓜列當Orobanche aegyptiaca为列当科Orobanchaceae列当属Orobanche一年生草本植物。由于缺少叶片、叶绿素和功能性根，列当完全寄生在寄主植物根系上，靠汲取寄主水分、养分及各类生长激素来维持自身生长，因此会对寄主造成严重危害[1]。据调查，在新疆受列当属植物危害的农作物（向日葵、甜瓜、加工番茄、打瓜、辣椒等）面积为5.3万～6.7万hm2，每年给新疆农业生产造成的损失超过5亿元人民币，且发生面积还有进一步扩大的趋势[2]。
由于列当寄生的特殊性，对列当进行有效防治是当今农业生产上的难题。利用列当病原微生物研制专化性强、对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应小且安全性高的生防菌剂，是目前防治该类杂草经济有效的方法之一。真菌是常见的生物防治微生物，列当生防微生物的研究主要集中在镰刀菌Fusarium spp.等列当病原菌和根瘤菌Rhizobium spp.等列当寄主植物共生菌上[3]。孔令晓等[4]报道利用致病镰刀菌Fusarium sp. L2菌株对向日葵列当Orobanche cumana进行田间生物防治，防治效果达92.4%，且对小麦、玉米、棉花、烟草和向日葵等作物安全。Thomas等[5]在出土向日葵列当上接种尖孢镰刀菌F.oxysporum的分生孢子培养液后，其死亡率可高达85%。尖孢镰刀菌 FoxyⅠ和 FoxyⅡ的孢子悬浮液也可显著降低锯齿列当O.crenata和分枝列当O.ramose的萌发率及寄生率[6]。除镰刀菌外，其他一些列当的病原菌也具有类似防除列当的潜能，Ulocladium botrytiss和洋葱曲霉Aspergillus alliaceus也具有类似防除列当的作用[7-8]。
为获得对瓜列当具有良好防治效果的真菌菌株，本研究从自然发病瓜列当病样中分离致病菌，采用盆栽瓜列当接种无菌发酵滤液筛选对瓜列当具有强致病性的菌株，测定其不同浓度的发酵液和发酵产物对瓜列当种子萌发抑制效果，采用形态学和分子生物学方法对其进行鉴定。以期为新疆本地瓜列当的防治提供生防菌株资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试种子和菌株：瓜列当种子采自吉木萨尔县加工番茄田自然成熟瓜列当植株，菌株分离自吉木萨尔县加工番茄田自然发病瓜列当植株茎基部。
供试培养基：1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL;2）马铃薯葡萄糖水培养基（potato dextrose broth，PDB）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL;3）马铃薯胡萝卜琼脂培养基（potato carrot agar，PCA）：马铃薯20 g、胡萝卜25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL;4）半固体培养基：蛋白胨10 g、麦芽糖40 g、酵母提取粉10 g、琼脂4 g、蒸馏水1 000 mL;5）大米培养基：大米80 g、酵母粉1.2 g、蒸馏水120 mL，封口、浸泡过夜。所有培养基均121℃灭菌30 min。
试剂与仪器：独脚金内酯（GR24）购于北京酷来博科技有限公司。真菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂均为国产分析纯。DWP-9272恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。YJ-VS-2型超净工作台，无锡一净净化设备有限公司。HZQ-X500型恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司。XYH-2A双目体视显微镜，上海光学仪器一厂。BK5000生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 微生物的分离与纯化
采用组织分离法在自然发病瓜列当植株病健交界处剪切0.2 cm×0.2 cm左右的组织，用70%乙醇处理1 min，3%次氯酸钠溶液消毒3 min，无菌水连续漂洗4次，用灭菌滤纸吸干表面水分后放置在PDA培养基平板上，（28±2）℃ 恒温培养箱中黑暗培养2～3 d。挑取菌落边缘菌丝进行纯化，连续纯化4次，并转接到PDA斜面试管中，4℃保存备用。
1.2.2 分离菌株对瓜列当的致病性测定
将纯化的供试菌株制成孢子悬浮液，采取针刺法、涂抹法和喷雾法3种方式进行致病性测定。针刺法：用接种针蘸取孢子悬浮液，分别针刺瓜列当的基部、中部和顶端;涂抹法：用涂布器蘸取孢子悬浮液，分别涂抹瓜列当植株上述3个部位，接种后用湿润的脱脂棉覆盖，用喷有无菌水的密封袋罩住，保湿24 h后摘下密封袋和脱脂棉。喷雾法：喷洒500 μL孢子悬浮液在出土的瓜列当植株上，用密封袋覆盖瓜列当植株保湿24 h后摘下;空白对照为无菌水，各处理及对照均为3次重复。2 d后开始调查瓜列当发病情况，7 d后结束调查。
1.2.3 发酵液对瓜列当种子萌发的抑制作用
瓜列当种子前期处理：将瓜列当种子用75%乙醇消毒1.5 min，1%的次氯酸钠消毒12 min，无菌滤纸上晾干备用。
供试菌株转接于PDA平板中，28℃活化48 h，将活化后的菌株移至PDB培养基中，28℃，135 r/min振荡培养12 h后即为种子液。取种子液5 mL转入装有100 mL PDB培养液的250 mL三角瓶中，28℃，135 r/min条件下振荡培养120 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液过滤获得无菌发酵滤液。将40粒瓜列当种子放置在装有whatman滤纸（GA/A）的培养皿中，每个培养皿中加入2 mL 0.05 mg/mL GR24和2 mL發酵滤液，PDB培养液对照处理中加入2 mL GR24和2 mL PDB，菌株发酵液和PDB分别设置为原液、25倍稀释液和50倍稀释液3个处理，空白对照（CK）中加入2 mL GR24和2 mL无菌水，3次重复。（25±2）℃黑暗条件下培养7 d，体视显微镜下观察瓜列当种子萌发情况并记录萌发数量，计算抑制率。
抑制率=
空白对照种子萌发率-处理种子萌发率空白对照种子萌发率×100%。
1.2.4 菌株JTF001对番茄植株安全性测定
将菌株JTF001制成1×108个/mL的孢子悬浮液，每株番茄上分别均匀喷洒5 mL孢子悬浮液，用密封袋覆盖番茄植株保湿24 h后摘下。以茄链格孢Alternaria solani 1×108个/mL的孢子悬浮液为对照;空白对照为无菌水，各处理及对照均为3次重复，3 d后开始调查番茄植株生长情况，10 d 后结束调查。
1.2.5 菌株JTF001固体发酵产物萃取液活性测定
将纯化的生防菌株接于PDA平板上培养5 d，打取菌饼接种于半固体培养基中，28℃，135 r/min振荡培养24 h后，即为半固体种子液;取半固体种子液5 mL转入大米培养基中，（28±2）℃，恒温培养箱中黑暗培养15 d，即得供试菌株大米固体发酵物。将大米固体发酵物进行机械粉碎，每瓶加入240 mL乙酸乙酯浸泡，超声萃取2次，旋转蒸发得到发酵产物，使用时用1 mL甲醇溶解，4℃保存。
于24孔板中每孔加入40粒消毒干燥的瓜列当种子、0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL发酵产物，发酵产物浓度分别为5、1、0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL;甲醇对照选用0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL 5 μg/mL甲醇;空白对照（CK）加入0.5 mL 0.05 mg/mL GR24和0.5 mL无菌水，每处理3次重复。25℃，遮光培养5 d后，体视显微镜下观察记录瓜列当种子萌发数量。
1.2.6 菌株JTF001形态学和分子生物学鉴定
形态学鉴定：观察成熟菌落形态、菌丝和分生孢子大小、形态和颜色等特征，分生孢子梗的形态特征，参考《中国真菌志·链格孢属》进行分类鉴定[9]。
分子生物学鉴定：采用真菌通用引物ITS基因、RNA聚合酶Ⅱ第2大亚基基因（rpb2）、翻译延伸因子基因（tef 1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）特异性引物进行PCR扩增测序[10-11]，引物序列如表1所示。
PCR反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至总体积50 μL。ITS反应条件：94℃预变性4 min;94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环;72℃延伸10 min。rpb 2反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环;72℃延伸10 min。tef 1反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性45 s，58℃退火55 s，72℃延伸40 s，共31个循环;72℃延伸10 min。gapdh反应条件：94℃预变性4 min;94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环;72℃延伸5 min。
PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测得的序列经NCBI进行BLAST比对后，用MEGA 5软件进行序列分析，构建系统发育树。
1.3 数据分析
本试验所有数据均采用3次重复，试验数据用DPS 16.0软件进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 分离菌株对瓜列当致病性
通过对瓜列当罹病植株进行组织分离，共获得14株真菌，盆栽接种试验结果（表2）表明，菌株JTF001发酵液针刺接种瓜列当2 d伤口处变褐坏死，有明显的缢缩现象，逐渐扩展到整个植株，接种后7 d整株枯萎，死亡;涂抹接种后2 d植株大面积变褐、萎蔫，7 d整株干枯死亡;噴雾接种后2 d使得瓜列当花萼变褐干枯，7 d整株枯萎死亡，而对照瓜列当植株生长状态良好（图1），说明菌株JTF001对瓜列当植株具有强致病性。
2.2 菌株JTF001发酵液对瓜列当种子萌发的抑制作用
菌株发酵原液可完全抑制瓜列当种子的萌发，抑制率达100%;25倍和50倍稀释液的抑制率分别为92.88%和87.62%（表3）。菌株发酵液对瓜列当种子萌发有较好的抑制效果。
2.3 菌株JTF001对番茄植株的安全性
由图2可知，喷洒茄链格孢A.solani孢子悬浮液后，番茄叶片有明显圆形和不规则形病斑，病斑及叶片边缘有明显黄色晕圈;而对照组和喷洒菌株JTF001孢子悬浮液对番茄植株生长未造成影响，说明菌株JTF001对番茄植株生长安全。
2.4 菌株JTF001固体发酵产物萃取物对瓜列当种子萌发的抑制作用
发酵产物萃取液浓度为5 μg/mL和1 μg/mL时对瓜列当种子萌发的抑制率均为100%;浓度为0.5、0.25 μg/mL和0.1 μg/mL时对瓜列当种子萌发抑制率分别91.03%、81.87%和60.04%（表4）。从图3可以看出，1 μg/mL处理组的瓜列当种子没有萌发，0.1 μg/mL处理组的瓜列当种子芽管明显缩短，对照组的种子芽管表面光滑，呈透明或半透明状，萌发正常。
2.5 生防菌株形态学和分子生物学鉴定结果
形态学鉴定：菌株JTF001在PDA培养基上25℃培养7 d，菌落呈圆形，1～3 d时菌落为白色，3 d后颜色逐渐变为灰绿色或褐色，外围新生菌丝为白色，菌落呈白色与墨绿色的同心轮纹状，菌落背面为灰白色;菌株JTF001在PCA培养基上25℃培养7 d，菌落初期为白色，后期中间逐渐变青褐色，菌丝发达;菌株JTF001在水琼脂培养基上菌落初期为褐色，后期皿中分布大量孢子，菌丝不发达。分生孢子倒棍棒形，卵形，倒梨形或近椭圆形，表面光滑，具3～6个横隔膜，1～3个纵、斜膈膜，分隔处不缢缩或略缢缩，孢子大小（12.59～40.26） μm×（7.39～14.01） μm。短喙柱状，淡褐色，（8.02～20.12） μm×（2.56～4.78） μm。其在不同培养基上的产孢结果显示，菌株JTF001在PDA和PCA培养基上产孢量小;在水琼脂培养基上产孢量极大（图4），初步鉴定其为链格孢属Alternaria spp.真菌。
分子生物学鉴定：以菌株JTF001的基因组DNA为模板进行保守基因序列扩增及测序，运用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4、RPB2-5F和fRPB2-7CR、EF1-728F和EF1-986R、GPD1 和 GPD2进行PCR反应分别获得 555、967、242 bp和589 bp的片段，将菌株的扩增序列与GenBank中序列进行同源性比较分析，ITS序列同源性比对结果显示，菌株JTF001与链格孢Alternaria spp.的一致性较高;rpb 2序列同源性比对结果显示，菌株JTF001与交链格孢Alternaria alternata（登录号：MK605898.1、XM-018535098.1、DQ677980.1）的一致性达99%;tef 1序列同源性比对结果显示，菌株JTF001与交链格孢（登录号：KU145273.1）的一致性达98%;gapdh序列同源性比对结果显示，菌株JTF001与交链格孢（登录号：MG674227.1、MK451976.1、LT707620.1）的一致性达98%。利用软件MEGA 5中邻接法构建聚类分析树状图，菌株JTF001和交链格孢均聚为同一分支（图5、图6、图7），结合形态学鉴定结果，将菌株JTF001鉴定为交链格孢Alternaria alternata。
3 讨论
瓜列当种子萌发后便形成吸器，吸附在寄主根部，通过吸收寄主的营养物质来维持自己的生长，因此，通过抑制瓜列当种子萌发，避免瓜列当与寄主建立寄生关系，是降低瓜列当对寄主造成伤害的有效途径。真菌中含有多种对瓜列当生长具有抑制作用的种类，王亚娇等[12]从感病的列当中分离出尖孢镰刀菌F.oxysporum Br-2，其发酵上清液对弯管列当O.cernua种子萌芽抑制率为71.79%;陈杰等[13]研究发现灰黄青霉Penicillium griseofulvum菌株CF3发酵液原液、10倍和100倍稀释液处理后瓜列当发芽管长度与对照相比分别缩短 100.00%、68.84%和 19.24%。本研究从患病的瓜列当茎基部分离到内生真菌JTF001，培养皿试验结果表明，菌株无菌发酵液原液、25倍稀释液和50倍稀释液抑制了瓜列当的种子萌发及萌发后瓜列当发芽管的生长。通过盆栽试验接种JTF001发酵液，瓜列当植株接种处有明显的缢缩现象，植株变褐色，严重时可使整株萎蔫死亡。
链格孢属真菌物种之间的相似度极高，仅凭形态学特征很难进行种类鉴定，因此，增加基因进化关系作为分类依据非常有必要。Somma等[14]基于翻譯延长因子基因、β-微管蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因和过敏原基因构建多基因联合系统发育树，对引起小麦黑斑病的164个链格孢菌菌株进行了鉴定，明确了菌株的种类及其进化关系。王彩霞等[15]基于 ITS，Alt-a1 和 gpd 序列构建系统进化树将引起葡萄叶斑病的链格孢鉴定为3个种。本研究采用形态学观察并结合ITS、rpb2、tef 1和gapdh基因标记技术对从患病瓜列当上分离的内生真菌JTF001进行鉴定，将菌株JTF001鉴定为交链格孢Alternaria alternata。
近年来，关于利用微生物的次生代谢产物开发除草剂的研究受到广泛的关注，并且许多研究证明，杂草专化致病菌产生的毒素有较好的除草剂开发潜力[16]。Zhou等[17]发现细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是防治棉田、烟田等重要杂草的一种生物除草剂。姜述君等[18]发现狭卵链格孢A. augustiovoidea产生的毒素对稗草的种子萌发和幼苗生长都有较强的抑制作用，在100 mg/L浓度下对稗草种子萌发和幼苗生长抑制率分别达100%和76%。本研究中交链格孢JTF001发酵产物萃取物在1 μg/mL浓度下对瓜列当种子萌发抑制率达100%。目前关于链格孢菌防治瓜列当的报道较少，下一步将继续研究链格孢菌毒素对瓜列当的生防机制，有望开发为瓜列当的生防除草剂。
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（责任编辑：杨明丽）
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