橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选
卢亚莉 张世鑫 杨署光 田维敏 史敏晶
摘 要：在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中，为获得可靠的基因表达结果，筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料，收集其中的胶乳，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件，综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证，筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b，其中ejf2是最佳内参基因，18S不适合作为本研究的内参基因。
关键词：橡胶树;死皮相关;内参基因;qRT-PCR
中图分类号：S794.1 文献标识码：A
Abstract：
In order to obtain reliable gene expression results for TPD-related study of rubber tree， the selection of suita-ble reference genes is very important. In the present study， using the latex from the healthy rubber tree， the third grade tapping panel dryness （TPD） tree and the TPD-recovering tree of ‘Reyan7-33-97 as the experimental materials， the expression stability of 20 candidate reference genes were evaluated by using quantitative real-time PCR （qTR-PCR） and softwares of geNorm， NormFinder and BestKeeper. The results showed that， reference genes eif2、ACT7a and UBC2bwere the top three stable genes in the healthy tree; UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b and ACT7b were all stable genes in the third grade TPD tree; UBC2b、eif2 and ROC3 were stable genes for the TPD-recovering rubber tree. Based on the different stable reference genes， relative expressions of HbDXS1， HbHMGS2 and HbNIN3 genes were analyzed respectively. The results showed that eif2 and UBC2b were a couple of stable reference genes for TPD-related study; the eif2 was the most stable internal reference gene; 18S gene was not suitable as reference gene for qTR-PCR in this study.
Keywords：
Hevea brasiliensis Muell. Arg.; TPD-related; reference genes; qTR-PCR
DOI：
10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.012
橡胶树死皮病，即割面干涸病（tapping panel dryness，TPD），是在橡胶树的割线上出現局部或全部不排胶的症状，在世界各国的植胶园中普遍发生，严重影响天然橡胶产量，缩短橡胶树的经济寿命，给橡胶产业带来严重危害。我国橡胶树死皮病发生情况尤其严重，成为当前天然橡胶产业的主要限制因子之一[1]，因此，探索死皮病的发生机理并寻求解决办法已成为当务之急。利用分子生物学手段，研究橡胶树死皮病发生和康复的分子机理已成为近年来的研究热点，其中，对差异表达基因的筛选则是进行基因功能研究和进行分子调控的基础。
基因表达分析的手段众多，单个RNA的稳态水平可以用不依赖PCR的方法如Northern blotting[2]和原位杂交[3]等来衡量，但这些技术耗时长，RNA用量大，实验难度较大，并且重现性较差。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的技术由于具有特异性强、灵敏度高、精确度高、重现性好、通量较高、动态范围较宽、无需后PCR处理[4-7]等优点而成为目前最受欢迎的mRNAs检测方法。但qRT-PCR的准确性受到样品间起始RNA的质量和数量、cDNA合成效率以及PCR扩增效率等诸多因素的影响[8]，控制和减少误差的一个较好的方法就是选择合适的内参基因。理想的内参基因的表达水平应该在不同的生理与环境条件下稳定不变[9]，但已有研究表明，生物体内并没有真正的、完全稳定的内参基因。目前，在植物qRT-PCR分析中普遍使用的内参基因有Actin、18S等，但已有研究发现一种植物中的某个较为理想的内参基因并不一定适合在其他植物中使用。因此，为获得准确的基因表达数据，每进行一项研究实验，筛选出试验条件下特异性的内参基因对获得准确的基因表达结果至关重要[6， 10]。一般用于植物和动物内参基因分析的常用软件是GeNorm、NormFinder和BestKeeper[11-12]，借用这些软件，筛选研究所需的合适的内参基因是可以实现的。
大量研究表明，常用的内参基因18S rRNA、HbActin在橡胶树中不具有普适性，不同的实验系统最好需要单独筛选内参基因。目前，关于橡胶树内参基因的报道主要是针对乳管分化、胶乳再生、排胶、不同组织、不同激素处理等展开，橡胶树死皮发生，尤其是死皮康复研究中，缺乏相应的内参基因的筛选。为准确研究死皮以及康复这一过程中相关基因的表达，对该过程中的內参基因进行分析，筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究选取18S rRNA（简称18S）、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、CYP2、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC2a、UBC2b、UBC1、UBC3、UBC4、ROC3、PTP、RH2a、RH2b、FP共20个基因作为健康橡胶树、死皮树和施用死皮康复营养剂后的死皮恢复植株相关研究中的候选内参基因，通过qRT-PCR技术，并借助GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对20个内参基因在‘热研7-33-97不同样品中的表达稳定性进行评价，以期筛选出合适的内参基因，为橡胶树死皮以及康复相关研究中的基因表达分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）无性系‘热研7-33-97定植于中国热带农业科学院海南儋州两院试验场。选取长势大致相同的‘热研7-33-97的健康割胶树、三级死皮树和施用死皮康复营养剂后的死皮恢复树作为试验对象，每种类型橡胶树至少3株重复。采用3 d一刀，1/2 S的割胶制度，按照以下方法分别采集不同的胶乳样品：（1）健康树距离地面1 m处连续割胶5刀，收集每一刀的胶乳，分别编号为0（CK）、1、2、3、4刀;（2）三级死皮树在正常割胶的情况下，针刺收集不排胶部位、点状排胶部位、连续排胶部位水囊皮中的胶乳;移液器收集点状排胶部位和连续排胶部位割线上的胶乳;（3）死皮后经施用康复营养剂恢复的橡胶树，距离地面1 m处连续割胶5刀，收集每一刀的胶乳，分别编号为0（CK）、1、2、3、4刀。收集的胶乳直接加入到裂解液SL中，混匀后，冰上保存，带回实验室后立即提取总RNA，于–80 ℃贮存备用。
1.2 方法
1.2.1 胶乳总RNA提取与cDNA合成 橡胶树的胶乳总RNA的提取根据RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）操作说明进行。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的总RNA的完整度和纯度。按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）试剂盒说明进行cDNA的反转录合成，合成产物于–20 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 内参基因的表达分析 根据已报道的橡胶树内参基因，选择CYP2、18S、ROC3、FP、PTP、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、RH2a、RH2b、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3和UBC4共20个基因作为候选的内参基因，采用Real-time PCR方法，分析这些基因在不同健康状况下橡胶树的不同部位和不同刀次收集胶乳中的表达情况。所选内参基因的PCR引物来源于本研究团队。
1.2.3 基因qRT-PCR分析 以cDNA为模板，分别对候选内参基因进行实时荧光定量PCR分析，反应平台为CFX384 Real-Time PCR Detection （Bio-rad， USA）。反应体系为10 L体系，反应程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。反应使用的试剂为2x Transstart Tip Green qPCR Super Mix。每个PCR反应进行3次技术重复。利用Bio-rad CFX manager 3.0软件，采用2–ΔΔCT算法分析基因的相对表达量。
1.3 数据处理
采用Gern Norm和Norm Finder软件对内参基因稳定性进行分析;Original 8.0软件绘制内参基因稳定性图;SPSS 19.0以及Excel 2007进行统计学分析;AI软件进行图形组合。以筛选出来的内参基因为参照，对所选的目的基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3的表达水平进行定量分析，验证内参基因的有效性。
2 结果与分析
2.1 巴西橡胶树胶乳总RNA质量检测
在qRT-PCR基因表达分析中，总RNA的质量直接影响后续实验结果。提取的胶乳总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示，28S rRNA和18S rRNA条带清晰完整（图1），无降解现象，亮度比值约为2∶1。NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific Inc.， USA）测定OD260/OD280比值在1.8～2.1之间，出现单个峰值，表明RNA完整性好，纯度较高，可用于后续研究。
2.2 内参基因Ct值分析
基因的Ct值大小与其表达量成反相关，Ct值越小，表达量越高，反之亦然[13]。对20个候选内参基因在不同胶乳样品中得到的Ct值进行分析发现，这些基因的Ct值在8～32之间，范围较广，表明不同基因表达的丰度存在较大的差异。其中18S的Ct值最小，表明其基因的表达量最高;CYP2的Ct值最高，表明其表达量最低;其余基因的Ct值介于15～25之间，分布较集中，表达丰度居中（图2）。
2.3 候选内参基因在不同样品中表达稳定性分析与评价
2.3.1 GeNorm分析 利用GeNorm软件对候选内参基因的相对表达量进行统计分析，通过计算基因的表达稳定值（M）评价基因的表达稳定性，基因的M值越小，表达越稳定[14]。根据内参基因的稳定性从低到高进行排序作折线图，除混合的胶乳样品外，其他样品中大部分基因的M值低于0.5，有较好的稳定性（图3）。
在健康树胶乳樣品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是eif2、RH2b、UBC2a、UBC3、eifAb、PTP、ADF4、eifAa、FP和UBC2b，并且其M值差异不大，均低于0.5。其中eif2、RH2b和UBC2a最稳定，M值约为0.4。最不稳定的3个内参基因为18S、CYP2、ROC3，M值高于0.75（图3A）。
在三级死皮树不同胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、UBC1、ACT7b，且M值差异不明显，均低于0.4，都可以作为合适的内参基因。其中，UBC3、eifAb和eifAa最稳定，M值约为0.2。最不稳定的内参基因为18S，M值高于1.0;其次为CYP2、eif3，但M值也在0.5以内（图3B）。
在死皮康复树胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10位的基因分别是UBC2b、eif2、ROC3、ADF4、PTP、UBC4、RH2b、UBC1、ACT7b、eifAb，且M值均低于0.5。其中，UBC2b、eif2和 ROC3最稳定，M值约为0.4。最不稳定的3个内参基因为RH2a、CYP2、eifAa，M值均高于0.6（图3C）。
在所有胶乳混合的样品中，有4个基因的M值大于1.5，其他基因的M值也在1.0偏上，总体来看，表达稳定性略差。稳定性排名前10的基因分别是eif2、UBC3、UBC4、UBC2a、eifAb、ACT7a、UBC2b、ACT7b、UBC1、ADF。其中，eif2、UBC3和UBC4最稳定，M值约为0.9。最不稳定的3个内参基因为CYP2、FP和 PTP，M值高达2.5以上（图3D）。之所以在这个组合中M值比较大，可能与胶乳样品是来自状态完全不同、差异明显的胶乳样品混合有关。
综上所述，根据M值的高低，在全部样品中均有良好稳定性的5个内参基因有eif2、UBC2b、RH2b、UBC3、UBC4，稳定性一直都较差的有18S和CYP2两个基因。
GeNorm软件还可以通过成对的变异值（Vn/Vn+1）来确定标准化所需的参考基因的最佳数量[8]，阈值上限是0.15，以确定所需内参的最佳数目。在此研究中，成对的变异值在0.15左右（图3E），利用GeNorm软件对配对组合（Vn/Vn+1）分析发现，在橡胶树的不同胶乳样品中选出2个内参基因就可以进行标准化，这与之前一些物种的研究相似[15-16]。
2.3.2 NormFinder分析 采用NormFinder软件分析稳定值（SV），其数值大小与稳定值呈负相关[17]，即数值越小稳定性越高，进一步验证geNorm分析的结果。
结果表明，在健康树胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是eif2、ACT7a、UBC2a、ADF4、RH2b、UBC3、UBC4、PTP、eifAb、UBC2b（图4A），其中有8个基因与geNorm评价的前10位基因相同;在三级死皮树胶乳样品中，排名前10位的基因分别是eifAb、eifAa、UBC2b、UBC3、RH2b、UBC4、ADF4、FP、ACT7a、eif2（图4B），其中也有9个基因与geNorm评价的前10位基因相同;在死皮康复胶乳样品中，排名前10位的基因分别是UBC2b、eif2、ROC3、ADF4、UBC4、PTP、RH2b、UBC1、ACT7b、eifAb，与geNorm评价的前10位基因排序一致（图4C）;在所有胶乳的混合样品中，排名前10位的基因分别是UBC4、eif2、UBC2a、UBC3、UBC2b、ACT7b、ACT7a、eifAb、UBC1、ADF，与geNorm评价的前10位基因相同（图4D）。综合来看，NormFinder和geNorm分析的实验结果中，得出eif2、UBC2b、UBC3、UBC4、RH2b稳定性好，而18S和CYP2表达稳定性较差的结果是一致的。
2.3.3 BestKeeper分析 BestKeeper软件可用于对候选内参基因在各样品中的平均Ct值进行分析[18]。一般稳定的内参基因在BestKeeper中具有较高的决定系数（coefficient of determination， R2）。由结果可知（表1），健康橡胶树胶乳的稳定性排名前10的基因依次是ACT7a、UBC2b、PTP、UBC3、eif2、FP、RH2b、RH2a、UBC2a、eifAb;三级死皮树胶乳则是RH2b、UBC2b、FP、UBC1、eifAa、ACT7a、eif2、UBC3、ACT7b、eifAb;死皮康复橡胶树胶乳则是FP、ROC3、UBC2b、eifAb、ADF、18S、eif2、RH2a、ACT7a、RH2b;在混合胶乳中则是：eif2、eifAa、ADF、ADF4、UBC3、eifAb、UBC2a、ACT7a、eif3、UBC4。
GeNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件的评估结果既有一致性，也有差异性。GeNormh和NormFinder的分析结果高度一致，而与BestKeeper的一致性略差。综合3种结果，eif2和UBC2b两个基因的稳定性表现最好，是合适的内参基因选择。
2.4 内参基因稳定性验证
根据软件分析结果，选择各样品中3个较稳定的基因和稳定性较差的18S基因，分别对HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3共3个胶乳代谢相关基因的相对表达量进行分析。结果表明，健康树不同割胶刀次之间，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3三个基因在以eif2、UBC2b、UBC2a为内参时的表达规律基本一致，而以18S为内参时则基本表现出相反的变化趋势（图5A）。
三级死皮树不同死皮程度部位采集的胶乳样品中，分别以稳定的UBC3、eifAb和UBC2b为内参分析时，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3三个目的基因的表达变化规律基本一致，并且相对健康树而言，表达量整体水平上降低。以18S为内参进行分析时，3个目的基因的表达规律明显不同于以3个稳定性好的内参基因为参照的结果，甚至出现近似于相反的表达规律（图5B）。
死皮康复树中，分别以稳定性好的eif2、UBC2b和ROC3为内参基因分析时，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3基因的表达规律基本一致，其中尤以eif2和UBC2b为内参时表达规律一致性更好;当以18S为内参进行分析时，基因的表达量和表达规律都与前3个内参有较大的区别（图5C）。
3 讨论
为获取准确的基因表达数据，内参基因的选择显得尤为重要。合适的、稳定的内参基因才能客观、真实地反映目标基因的相对表达量。已有研究表明，内参基因不具有通用性。不同的物种、不同的组织、不同的发育阶段，甚至不同的处理条件下都可能需要不同的内参基因，不经筛选而直接选用常见的内参基因可能使分析结果的精确性降低甚至导致得出错误的结论。目前，筛选内参基因常用的方法主要有Genorm、NormFinder、BestKeeper[8，17-18]。Manoli等[19]利用这些方法研究了玉米在不同实验条件下、不同组织中12个内参基因的差异，筛选得到在玉米中肌动蛋白（ACT）的稳定性较好，而18S的稳定性差。早期在橡胶树qRT-PCR分析中常采用18S作为内参基因，后来该基因也被发现并不适合作为橡胶树所有的基因研究中的内参。Li等[4]认为在橡胶树不同组织中RH2b和UBC2b稳定性较好，在割胶处理中eifAb稳定性较好。何斌[20]对20个内参基因进行分析，认为适合胶乳再生研究的内参基因是UBC4、ADF、UBC2a、eif2、ADF4。Long等[21]在连续割胶实验中评估了22个候选基因，认为稳定性好的前5个参考基因分别为UBC2a、UBC2b、UBC4、UBC3和ADF。Chao等[22]针对不同排胶时间筛选出合适的胶乳内参基因是UBC2a和UBC2b。最近，吴绍华等[23]研究TSA诱导乳管分化过程中筛选的最佳内参基因是UBC3。由此可见，橡胶树有关分子机理的研究中，也没有一个普适的内参基因。针对不同的实验系统，有必要筛选相应的最适内参基因。死皮相关尤其是包含死皮康复树方面的qRT-PCR内参基因筛选的研究尚未见报道，为研究死皮发生以及死皮康复的分子机理，寻找合适的内参基因显得尤为重要。
本研究是针对橡胶树死皮相关研究展开的内参基因筛选，通过3个计算软件比较了20个候选内参基因的表达稳定性。结合基因稳定性验证，综合分析认为eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中是最为稳定的3个内参基因;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树不同部位中都表现出较好的稳定性;ROC3、eif2和UBC2b在三级死皮恢复树中是较稳定的基因。可见，在3种类型的橡胶树中都有良好的稳定性表现的内参基因是eif2和UBC2b，尤其其中的eif2一直都有良好的稳定性，即使在所有胶乳混合这样的来源差异比较大的样品中也是最稳定的。因此，在死皮相关研究中，认为eif2和UBC2b是最佳的一组内参基因，而其中的ejf2是最佳的内参基因。18S表达丰度在20个候选基因中最高，但稳定性最差，基因验证也表明不适合作为死皮相关研究的内参基因。
本研究中利用了Genorm、NormFinder、BestKeeper三种方法来分析候选基因的稳定性，但其中Genorm和NormFinder的分析结果一致性更高，与最终分析的结果更吻合，是较适合用来筛选内参基因的软件。
参考文献
[1] 何 晶， 冯成天， 郭秀丽， 等. 高浓度乙烯利刺激诱导橡胶树死皮发生过程中的胶乳生理研究[J]. 西北林学院学报， 2018， 33（2）：
123-128.
[2] Alwine J C， Kemp D J， Stark G R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzy-loxymethyl-paper and hybridization with DNA probes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1977， 74（12）：
5350-5354.
[3] Kupper H， Seib L O， Sivaguru M， et al. A method for cellu-lar localization of gene expression via quantitative in situ hybridization in plants[J]. Plant Journal， 2007， 50（1） ：
159-175.
[4] Li H P， Qin Y X， Xiao X H， et al. Screening of valid refer-ence genes for real-time RT-PCR data normalization in He-vea brasiliensis， and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Science， 2011， 181（2）：
132-139.
[5] 袁 偉， 万红建， 杨悦俭. 植物实时荧光定量PCR内参基因的特点及选择[J]. 植物学报， 2012， 47（4）：
427-436
[6] Ginzinger D G. Gene quantification using real-time quantitative PCR：
an emerging technology hits the mainstream[J]. Experimental Hematology， 2002， 30（6） ：
503-512.
[7] Garson J A， Grant P R， Ayliffe U， et al. Real-time PCR quantitation of hepatitis B virus DNA using automated sam-ple preparation and murine cytomegalovirus internal con-trol[J]. Journal of Virological Methods， 2005， 126（1）：
207-213.
[8] Vandesompele J， Preter K D， Pattyn F， et al. Accurate nor-malization of real-time quantitative RT-PCR data by geome-tric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）：
467-470.
[9] 黄雪玲， 冯 浩， 康振生. 小麦条锈菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择[J]. 农业生物技术学报， 2012， 20（2） ：
181-187.
[10] Radoni? A， Thulke S， Mackay I M， et al. Guideline to refer-ence gene selection for quantitative real-time PCR[J]. Bio-chemical and Biophysical Research Communications， 2004， 313（4）：
856-862.
[11] 姜 婷， 苏 乔， 安利佳. 多重胁迫下玉米实时定量PCR内参基因的筛选与验证[J]. 植物生理学报， 2015， 51（9）：
1457-1464.
[12] Chen K， Fessehaie A， Arora R. Selection of reference genes for normalizing gene expression during seed priming and germination using qPCR in Zea mays， and Spinacia olera-cea[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2012， 30（2）：
478-487.
[13] 闻志彬， 张明理. 松叶猪毛菜干旱胁迫下实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 植物生理学报， 2015， 51（11）：
2031-2038.
[14] 黄琼林， 梁凌玲， 何 瑞， 等. 青天葵实时荧光定量PCR内参基因的选择[J]. 中草药， 2013， 44（14）：
1979-1983.
[15] Reddy D S， Bhatnagar-Mathur P， Cindhuri K S， et al. Evalu-ation and validation of reference genes for normalization of quantitative real-time PCR based gene expression studies in peanut[J]. PLoS One， 2013， 8（10）：
e78555.
[16] Taylor C M， Jost R， Erskine W， et al. Identifying stable reference genes for qRT-PCR normalization in gene expres-sion studies of narrow-leafed Lupin （Lupinus angustifolius L.）[J]. PLoS One， 2016， 11（2）：
e0148300.
[17] Andersen C L， Jensen J L， Orntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：
a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research， 2004， 64（15）：
5245-5250.
[18] Pfaffl M W， Tichopad A， Prgomet C， et al. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity：
Best Keeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters， 2004， 26（6）：
509-515.
[19] Manoli A， Sturaro A， Trevisan S， et al. Evaluation of candi-date reference genes for qPCR in maize[J]. Journal of Plant Physiology， 2012， 169（8）：
807-815.
[20] 何 斌. 橡胶树胶乳再生过程中糖代谢相关基因的表达与胶乳生理生化参数分析[D]. 海口：
海南大学， 2015.
[21] Long X， He B， Gao X， et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during latex regeneration in rubber tree[J]. Gene， 2015， 563（2）：
190-195.
[22] Chao J， Yang S， Chen Y， et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of the gene expression in laticifers on the basis of latex flow in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7：
1149.
[23] 吳绍华， 张世鑫， 杨署光， 等. TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选[J]. 热带作物学报， 2020， 41（3）：
504-512.
责任编辑：白 净
猜你喜欢 橡胶树 天然橡胶种植管理技术研究农民致富之友(2019年29期)2019-10-21生如橡胶树散文选刊·下半月(2018年2期)2018-02-23中国热科院在橡胶树低温应答机制研究中取得重要进展世界热带农业信息(2018年7期)2018-01-19橡胶树根病发生特点及综合治理措施农业工程技术·综合版(2016年10期)2017-04-22橡胶树开割季在5月已经开始世界热带农业信息(2016年6期)2016-07-02不同品系橡胶树的花序性状差异研究热带农业科学(2015年1期)2015-02-15