以cytC基因为靶标的LAMP快速检测番茄溃疡病菌方法的建立
刘燕妮 毛芙蓉 范慧冬 郑士金 侯柏森
摘要：以番茄细菌性溃疡病病菌的特异性基因cytC为检测靶标，以番茄溃疡病病菌等8种病原细菌为供试菌株。根据检测靶标设计环介导等温扩增（LAMP）引物并进行特异性和灵敏度检测。结果显示，引物cytC-170能特异性检测出番茄溃疡病病菌，检测灵敏度高达5×105 copy/μL，环引物的加成将试验进程缩短为33.06 min，使整个反应控制在50 min内。研究建立的LAMP检测方法操作简单，结果可视，非常适用于番茄细菌性溃疡病病菌的现场快速检测。
关键词：番茄溃疡病病菌;LAMP;特异性;检测;cytC基因;加环试验
中图分类号：S436.412.1+9 文献标志码：
A
文章编号：1002-1302（2021）11-0072-04
收稿日期：2020-09-01
基金项目：吉林省重点科技攻关项目（20140204032NY）。
作者简介：刘燕妮（1988—），女，山东青岛人，硕士，助理研究员，研究方向为蔬菜病害综合防治。E-mail：704870590@qq.com。
通信作者：毛芙蓉，硕士，副研究员，研究方向为蔬菜病虫害综合防治。E-mail：5155885@qq.com。
番茄细菌性溃疡病病菌是我国禁止入境的检疫性有害微生物，1954年我国首次报道该病害，之后便迅速蔓延，现在在黑龙江、吉林、山东、辽宁、河北、四川等地均有发生，每年给番茄带来25%～75%的经济损失，严重制约着番茄产业的发展。番茄细菌性溃疡病由密执安棒状杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，以下简称为Cmm）引起，除侵染番茄外，还可侵染辣椒、裂叶茄、龙葵、烟草、天仙子等47种茄科植物[1-2]。这些植物的病残体都可作为病害再次流行的初侵染源。有关报道表明，当番茄体内的病菌浓度达到1×108～1×109 CFU/mL时，番茄就会表现出被害症状[3]，当番茄种子的带菌率达1%以上时，便可引起病害的快速流行[4-5]。因此进行番茄溃疡病病菌的初期检测并进行有效防治是预防该病发生的最有效手段。
目前，针对番茄细菌性溃疡病病菌的检测方法主要有半选择性培养基的富集培养[6]、菌株的致病性测定[7]、血清学检测、DNA 探针[8]以及PCR[9]等方法，但这些检测方法都存在操作复杂、准确率低以及技术要求高等各方面的限制。本研究使用建立的环介导等温扩增（LAMP）检测方法对技术要求低、灵敏度高、特异性强、操作简便，更适用于番茄细菌性溃疡病病菌的早期检测。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本研究使用的菌株番茄细菌性溃疡病病菌[Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Smith） Davis et al.]，由筆者所在实验室自主分离和中国农业大学种子病理中心提供;番茄青枯假单胞菌和茄青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum E. F.Smith），均由广东省微生物保存中心提供;黄瓜角斑病病菌[Pseudomonas syringae pv. lachrymans （Smith & Bryan） Yong，Dye & Wilkie]和西瓜果斑病病菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.），均由吉林农业大学植物病理实验室提供;马铃薯环腐病病菌[Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum （Spieckermann & Kotthoff） Davis，Gillaspie，Vidaver and Harris]和马铃薯疮痂病病菌[Streptomyces scabies （Thaxte） Waks.et Henvici]，均由笔者所在实验室自主保存。
1.2 培养基
NA培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母粉3.0 g、琼脂粉16～18 g，定容至1 000 mL，调pH值至7.0，121 ℃灭菌30 min。LB液体培养基：蛋白胨 10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g，定容至1 000 mL，调pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min。
1.3 LAMP反应体系的建立
试验于2015年4—12月在吉林省蔬菜花卉科学研究院植物保护实验室内进行。
1.3.1 细菌基因组DNA的提取
将供试菌株在NA培养基上活化培养后，转至LB液体培养基中进行恒温振荡培养至菌液浓度为108 CFU/mL。培养好的菌株使用细菌基因组提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌体DNA，并用ND 1000分光光度计检测DNA质量和浓度，于-20 ℃保存备用。
1.3.2 LAMP引物设计
根据PCR的试验结果[10]，针对特异性基因（cytC基因），使用Primer Premier 5.0设计LAMP反应内外引物及环引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成及纯化。
1.3.3 LAMP反应体系
利用设计的内外引物及环引物（引物均稀释到100 μmol/L），使用广州华峰生物科技有限公司生产的通用型恒温实时荧光试剂盒进行LAMP反应。反应体系：2×LAMP reaction mixture 12.5 μL、荧光染料0.25 μL、Bst酶 0.5 μL、引物 1.0 μL （内、外引物终浓度分别为1.6、0.2 μmol/L）、环引物 （100 μmol/L） 0.2 μL（终浓度为0.8 μmol/L）、DNA模板 2.0 μL，用水定容至25 μL。反应程序：63 ℃，70 min。
1.3.4 加环后反应体系
使用广州华峰生物科技有限公司生产的冻干通用型恒温实时荧光试剂盒进行LAMP反应。反应体系：复溶液15 μL、引物1.0 μL（内、外引物终浓度分别为1.6、0.2 μmol/L）、环引物（100 μmol/L） 0.2 μL （终浓度为0.8 μmol/L）、 DNA模板2.5 μL，用水定容至25 μL。反应程序：63 ℃，70 min。
1.3.5 LAMP 方法引物筛选
将设计好的内外引物加到反应体系中进行等温扩增，采用荧光定量PCR仪器进行LAMP反应，在每个循环结束时读取荧光信号值，判断引物扩增效果。
1.3.6 LAMP 方法特异性检测
使用表1中所列的LAMP反应所需引物进行特异性检测，以无菌水为空白对照，验证LAMP检测的特异性。结果通过3种不同的方法进行判断：将LAMP产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测;采用荧光定量PCR仪器进行LAMP反应，在每个循环结束时读取荧光信号值;将LAMP产物离心，使管盖上的显色物质进入产物，观察显色情况。
1.3.7 LAMP 方法灵敏度检测
利用筛选出的引物组，对番茄溃疡病病菌进行扩增，检测LAMP反应的灵敏度。提取番茄溃疡病病菌的DNA，并进行不同浓度的稀释使其终浓度分别为5、50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106 copies/μL共7个浓度作为各个梯度的DNA 模板，以无菌水为空白对照进行LAMP反应的灵敏度检测。结果判断同“1.3.6”节。
2 结果与分析
2.1 LAMP引物筛选
使用设计引物cytC-170和cytC-49对Cmm进行特异性扩增，结果如图1所示。引物cytC-170能扩增出目的片段，可以进行后续试验，而引物cytC-49 扩增效果不理想，不能扩增目的片段。因此选择引物cytC-170进行下一步试验。
2.2 LAMP检测加环试验
对筛选出的cytC-170引物组进行环引物加成处理，将处理后的引物组重新进行LAMP反应，通过试验结果（图2）可以看出，加环后扩增时间从47.27 min缩减为33.06 min;反应时间约缩短1/3，扩增速度明显加快，更有利于检测的进行。
2.3 cytC基因LAMP特异性检测
利用供试菌株对筛选优化的cytC-170引物组进行特异性检测，结果（图3）显示，3种检测方法均证明cytC-170基因只能从Cmm样品中获得预期目标产物，而在番茄青枯假单胞菌、黄瓜角斑病病菌等病原细菌中均不能获得目标片段，表明cytC-170基因能通过LAMP检测的方法特异性检测出番茄溃疡病病菌。
2.4 cytC-170基因LAMP灵敏度性检测
对筛选出的cytC-170引物组进行灵敏度检测，结果（图4）显示：3种检测方法均证明，当病菌的浓度达到5×105 copies/μL时，cytC-170基因能很好地扩增出目的片段，可用于检测Cmm。
3 讨论与结论
番茄溃疡病是一种系统性维管束病害，植株发病后病情可以随流水、农事操作等迅速蔓延，可能给番茄生产带来毁灭性打击。进行番茄溃疡病病菌的早期检测预防能够有效减少该病带来的损失。有关报道表明，只有当番茄植物体内的Cmm浓度达到1×108～1×109 CFU/mL时，番茄才会表现出被害状[3]，本研究建立的以cytC基因为检测靶标的LAMP检测方法，检测灵敏度为5×105 copies/μL，远低于发病浓度，能够达到早期检測的要求。
针对番茄溃疡病病菌的检测广大学者也进行了广泛研究，但是选择培养基的富集培养[6]及接种紫茉莉叶片引起过敏性坏死反应[7]存在耗时长的缺点;血清学检测及DNA探针、PCR等方法有效缩短了检测时间。但是血清学检测存在检测灵敏度低;DNA探针不能区分致病与非致病菌株;PCR检测存在耗时长，对操作人员技术要求高等缺点，不适用于检测的推广。本研究选取了与致病性相关的cytC基因，而非高保守性的16S rRNA序列以及高变异性的ITS序列，有效避免了假阳性。建立的LAMP检测方法操作简单简便，只需要1台恒温水浴锅便可完成;耗时短，反应时间为33.06 min，整个检测过程可控制在50 min内，比常规PCR和实时荧光 PCR检测能更早得到反应结果。虽然PCR检测的灵敏度要高于LAMP检测，但是PCR检测相对要求比较高，而LAMP检测更快速、便捷，只需一个恒等温的环境即可，更适用于生产应用。
参考文献：
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