福州市新型冠状病毒全基因组测序和进化分析
陈智伟 姚栩 谢乃鸿 陈艳 张晓阳
摘要：目的 全基因组测序用于福州地区2019新冠病毒（nCov-2019）病原的基因组进化分析。方法 构建捕获法-病毒全基因组测序方法，利用Tn5酶能够设别切割双链DNA并挂上特定标签的特性构建SARS-cov2的测序文库，使用MiSeq进行测序。结果 我们对5例CT值低于35的新冠核酸阳性标本进行建库，获得3株（FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398）覆盖率大于95%的病毒株序列。讨论 课题数据可用于提高新型冠状病毒监测网络的监测能力。
【中图分类号】R563.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）07-409-01
介绍
2019年12月，中国湖北省武汉市出现了一种新型冠状病毒[1]被指定为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2），该疾病被称为冠状病毒病2019（COVID-19）。世界卫生组织宣布该疾病为国际关注的突发公共卫生事件[2]，该项研究中，我们进行全基因组测序，并应用于SARS-CoV-2的临床标本。
方法
标本采集
标本的收集与前处理：收集福州地区新型冠状病毒qPCR阳性的标本5份，进行RNA提取并采用Random引物进行反转录（去人基因组gRNA的试剂）。
构建捕获法-病毒全基因组测序方法
利用多重扩增方案快速扩增新冠病毒的全基因组序列，利用Tn5酶能够设别切割双链DNA并挂上特定标签的特性构建SARS-cov2的测序文库，使用MiSeq进行测序，并对下机数据通过生物信息学方法进行分析获得福州地区SARS-cov2的全基因组序列。将福州地区的序列信息与各地公开数据比对探索福州地区新冠肺炎病人的来源。
系统发育和序列分析
结果：
我们采集的5份新冠核酸阳性标本，进行测序建库，其中覆盖率高于95%的病毒有三株分别是FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398。我们进一步下载了所有完整和高覆盖率的基因组截至2020年3月14日来自GISAID的序列。一株参考菌株（登录号MN908947.3）从GenBank（NCBI）下载。使用MAFFT对3个序列进行比对（版本7.427）进行进一步分析。系统发育系统进化树显示福州的SARS-CoV-2病毒基因组位于和武汉标准株进化枝中（图1）。这三株的与武汉新冠标准株的同源性高达99.5%、99.2%和98.9%。最分散的应变3个福州病毒序列中有FZ20LG957，显示9个核苷酸变化（与FZ20LG1462相比）（导致5个氨基酸变化）。值得注意的是，我们在基因组位置27，848-发现了32个核苷酸（nt）序列的缺失FZ20LG1462中的27，894-27，927。
图1. FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398三株新冠病毒株基因组进化分析
讨论
这项研究完成了3株病毒株基因组测序。利用MAGE-X软件中的Neighbor-Joining tree构建溯源树探究福州地区主要的病毒来源地区。通过系统发育树分析表明这些序列位于不同的进化枝，根据测序获得的序列和已公开序列构建fasta格式文件。3个基因组中观察到更少的核苷酸差异。我们检测到一个32 nt缺失，几乎覆盖了该序列的整个开放阅读框。一个相似的据报道，新加坡有8名住院患者接受了观察。在SARS冠状病毒2003年爆发期间，观察到ORF8缺失，这与减少人细胞中病毒复制的能力[3-4]。基因组这些病毒的变异被认为有助于成功适应环境。进一步的研究是需要调查SARS-CoV-2 nsp14在复制保真度中的功能[5]。从不同位置及时共享SASR-CoV-2的完整基因组对于监测病毒的遗传变化，这些变化可能与病毒传播和临床表现[6]。我们确定了福州不同地区的SARS-CoV-2序列进化枝。
参考文献：
[1]Zhu N， Zhang D， Wang W， Li X， Yang B， Song J， et al. A Novel Coronavirus from Patients 219 with Pneumonia in China， 2019. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382（8）：727-33. 220
[2]Coronavirus disease （COVID-2019） situation reports. [cited 2020 March 26]; 221 https：//www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports 222
[3]Number of Confirmed Cases of COVID-19 in Taiwan. [cited 2020 March 26]; 223 https：//sites.google.com/cdc.gov.tw/2019-ncov/taiwan 224
[4]Bolger AM， Lohse M， Usadel B. Trimmomatic：
a flexible trimmer for Illumina sequence data. 225 Bioinformatics. 2014 Aug 1;30（15）：2114-20. 226
[5]Kim D， Langmead B， Salzberg SL. HISAT：
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[6]Bankevich A， Nurk S， Antipov D， Gurevich AA， Dvorkin M， Kulikov AS， et al. SPAdes：
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福州市科技局新冠肺炎項目 020-XG-026
作者简介：陈智伟（1979-），男，博士研究生，主管技师，分子病毒学
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