稗草生防菌NX2A的鉴定、安全性及对稗草的致病条件
钟加日 刘璐 曾颖 朱哲远 柏连阳 彭迪
摘要：【目的】明確分离自感病稗草叶片的菌株NX2A的分类学属性、对农田常见作物的安全性及对稗草的致病条件，为菌株NX2A的田间应用提供理论依据。【方法】结合形态学观察和ITS序列分析确定菌株NX2A的分类学属性;通过作物安全性评价明确菌株NX2A对农田常见作物水稻、油菜、辣椒、番茄和茄的安全性;选用L9（34）正交表，以湿度、稗草叶龄、光照时间和孢子浓度为考察因素，以病情指数和鲜重防效为考察指标，进行菌株NX2A致病条件试验。【结果】结合菌株NX2A的形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将菌株NX2A鉴定为新月弯孢菌（Curvularia lunata）;作物安全性评估试验结果表明，菌株NX2A孢子悬浮液对水稻、油菜、辣椒、番茄和茄的生长无明显影响，植株叶片未见与稗草相同或类似的病斑;菌株NX2A对稗草的致病条件测定结果表明，各因素影响菌株NX2A对稗草病情指数的顺序为光照时间>孢子浓度>湿度>稗草叶龄，影响菌株NX2A对稗草鲜重抑制率的顺序为孢子浓度>光照时间>湿度> 稗草叶龄。菌株NX2A防控稗草的最优组合为A3B1C3D2，即以浓度为5.0×106个/mL的孢子悬浮液喷施于1叶期稗草，12 h光照、85%湿度保湿培养。【结论】新月弯孢菌菌株NX2A对稗草有较好的防控效果，且对水稻、油菜、辣椒、茄和番茄等作物安全，具有作为水田稗草生物防控的潜力。
关键词：
稗草;新月弯孢菌;安全性;致病条件
中图分类号：
S451.1 文献标志码：
A 文章编号：2095-1191（2022）02-0469-08
The identification， safety， and efficacy of the biocontrol fungi NX2A for Echinochloa crusgalli
ZHONG Jia-ri LIU Lu ZENG Ying ZHU Zhe-yuan BAI Lian-yang PENG Di
（1College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2Biotechnology Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3Anxiang County Plant
Protection Station of Hunan Province， Changde， Hunan 415600， China）
Abstract：【Objective】The strain NX2A was isolated from the leaves of susceptible Echinochloa crusgalli. Its taxonomic properties， safety for common farm crops， and pathogenic conditions for barnyard grass were studied to provide a theoretical basis for biological control of E. crusgalli. 【Method】The strain was identified by morphological charaterization combined with ITS sequence analysis. The safety of NX2A on common crops like rice， rape， pepper， tomato and eggplant was determined via safety evaluation. L9（34） orthogonal experiment was used in the pathogenicity experiment of NX2A. Humidity， leaf stage， light and inoculation concentration was chosen as factors， disease index and the inhibition rate of fresh weight were as evaluation indexes. 【Result】The pathogenic strain NX2A was identified as Curvularia lunata according to morphological identification and molecular identification. The spore suspension of NX2A had no obvious effects on rice， rape， pepper， eggplant and tomato. Plant leaves did not show the same or similar disease spots as barnyard grass. The results of pathogenicity experiment showed that the degree of the influence on disease index were in the order：light > inoculation concentration > humidity > leaf stage; the degree of the influence on fresh weight were in the order：inoculation concentration > light > humidity > leaf stage. The optimum treatment was A3B1C3D2， namely， 85% humidity， the 1-leaf stage， 12 h light， inoculation concentration was 5.0×106 spores /mL. 【Conclusion】C. lunata strain NX2A has a good prevention and control effect on barnyard grass， and is safe for rice， rape， pepper， eggplant， tomato， and has the potential of biological prevention and control of barnyard grass in paddy field.
Key words：
Echinochloa crusgalli; Curvularia lunata; safety; pathogenicity conditions
Foundation items：National Modern Agricultural Industrial Technology System（CARS-16-E19）; The Key Laboratory Project of Weed Biology and Safety Prevention and Control in Hunan （2015TP1016）
0 引言
【研究意義】水稻是我国三大主要粮食作物之一，其产量与我国及世界的粮食安全息息相关（赵凌等，2015）。稗草（Echinochloa crusgalli）是一种一年生草本植物，其生长势、繁殖速度及竞争水分等能力强于水稻，且是部分水稻病害的中间宿主，致使水稻大幅减产，严重时甚至绝收（佟瑶等，2021）。防控稗草的方法有物理防治、化学防治和生物防治。目前化学除草剂因便捷有效、低成本等优点，已成为稗草防控的主要措施，但长期、大量及不合理使用，造成农药残留、生物多样性降低等生态问题，且化学除草剂作用靶标位点单一，稗草对化学除草剂已产生不同程度的抗性（刘兴林等，2015;左平春等，2017;李香菊，2018）。马国兰等（2021）的研究结果表明，在长江中下游地区7省70个稗草田间种群均对五氟磺草胺产生了不同程度的抗药性，高水平抗性种群达50.7%。鉴于物理防治稗草的效率低下，以及化学除草剂带来的生态及抗药性等问题，迫切需要开展稗草生防菌研究工作，为生产上防治稗草提供科学依据。【前人研究进展】利用控草微生物防除杂草是未来杂草防控的重要途径和发展方向。控草微生物中利用最多的是控草真菌，国内外在控草真菌的新菌株筛选及商品化等方面进行了大量研究，有20个以上微生物除草剂得到应用（陈世国和强胜，2015;朱海霞和马永强，2020）。微生物除草剂具有降解性好、安全性高、对环境污染小等优点，大力推广使用微生物除草剂对发展环境友好型的生态农业具有重要意义（张红梅等，2021）。但微生物除草剂的使用常受到田间环境的影响，从而出现田间杂草防效不稳定等现象，致使微生物除草剂在杂草防除中占比较低（陈世国和强胜，2015）。因此，探索影响控草微生物对杂草防效的主要因素，对微生物除草剂的成功应用以及对杂草的防控起到关键作用。对此已有学者开展了一系列研究。韦韬等（2011）通过单因素法表明接种时稗草叶龄、接种后保湿时间、接种浓度是生防菌新月弯孢菌（Culvularia lunata）菌株J15（2）对稗草防效的影响因素;Li等（2013）采用单因素法表明接种时稗草叶龄、接种后保湿时间、接种浓度是新月弯孢菌菌株B6对稗草防效的影响因素;李健等（2016）以单因素法确定湿度是ZC201301对马唐防效的影响因素。然而多数研究者使用单因素法来考虑防控影响因素，选择出的最佳试验条件只是依靠单因素最佳条件的集合，缺乏对在田间整体环境影响的综合性研究。【本研究切入点】菌株NX2A是本课题组前期从感病稗草叶片上分离获得的一株稗草致病菌，但尚未对其分类学属性及对农田常见作物的安全性和对稗草的致病条件开展研究。【拟解决的关键问题】综合形态学观察和ITS序列分析确定菌株NX2A的分类学地位;通过作物安全性评价明确菌株NX2A对农田常见作物的安全性;选用L9（34）正交表，以湿度、稗草叶龄、光照时间和孢子浓度为考察因素，以病情指数和鲜重抑制率为考察指标，进行菌株NX2A致病条件试验，获得菌株NX2A对稗草防效的主要影响因子及理论最优组合，综合考察菌株NX2A在复杂环境中对稗草的防效，以期为控草微生物的田间应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试菌株：菌株NX2A，由湖南省农业科学院生物技术研究所微生物学研究室提供，于2018年分离自感病稗草叶片。供试植物：稗草、水稻（Oryza satiua）、油菜（Brassica napus）、辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanumly copersicum）、茄（Solanum melongena）。培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15～20 g，去离子1 L，pH 7.0）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 孢子悬浮液制备 将菌株NX2A接种于PDA培养基，28 ℃下黑暗培养14 d，用0.05%吐温80无菌水溶液刮洗培养基表面菌体，将孢子悬浮液置于已灭菌三角瓶内，充分振荡后用已灭菌的脱脂棉进行过滤，再以血球计数板计数，确定孢子悬浮液浓度。
1. 2. 2 菌株NX2A鉴定 形态鉴定：将菌株NX2A接种于PDA培养基，28 ℃下黑暗培养10 d，期间观察并记录菌落形态。使用0.05%吐温80无菌水溶液刮洗培养基表面菌体，使孢子脱落，制成孢子悬浮液，于显微镜下观察菌株NX2A的分生孢子形态，结合《真菌鉴定手册》（魏景超等，1979）对菌株NX2A进行形态鉴定。
分子生物学鉴定：用CTAB法提取菌株NX2A的全基因组DNA（张颖慧等，2008），以引物ITS1（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"）和ITS4（5"-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3"）进行rDNA-ITS特异性扩增，PCR反应体系40.0 μL：2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 20.0 μL（天根生化有限公司），DNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O补足至40.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸5 min。反应结束后，取2.5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在UNITE 4.0数据库中进行massBLASTer比对分析（Nilsson et al.，2019），根据比对结果使用MEGA-X10.2.1的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。
1. 2. 3 菌株NX2A对农作物的安全性评估 将浓度为5×106个/mL的孢子悬浮液喷施于2叶期水稻、油菜、辣椒、茄和番茄植株上，28 ℃下12 h光照保湿24 h后，转入温室继续培养，以喷施0.05%吐温80为阴性对照，以相同浓度孢子悬浮液喷施于2叶期稗草植株为阳性对照，试验设3个重复。接种10 d后，观察植株发病情况。叶片发病程度分级标准：0级，叶片无任何病斑;1级，叶片上有病斑零星分布;2级，1/3～2/3叶片烂死;3级，2/3以上叶片烂死;4级，叶片全部烂死（李永龙，2013）。
1. 2. 4 菌株NX2A对稗草的致病条件测定 以湿度、稗草叶龄、光照时间和孢子浓度为因素，每因素3个水平，设计4因素3水平9处理的正交试验（表1）。以处理对应浓度孢子悬浮液喷施于相应叶期的稗草植株上，相应光照时间、相应湿度在28 ℃恒温箱24 h后转入温室培养。以喷施0.05%吐温80为空白对照，试验重复3次。接种10 d后调查稗草发病情况，按公式1计算病情指数。收集稗草地上部分，按公式2计算鲜重抑制率。
病情指数（%）=[Σ（病级叶片数×对应级别数）/调查叶片总数×最高级别数]×100 （1）
鲜重抑制率（%）=（对照鲜重-处理鲜重）/对照鲜重×100 （2）
1. 3 统计分析
试验数据采用DPS 9.01进行统计分析，用显著差数法（LSD）进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2. 1 菌株鉴定结果
2. 1. 1 形态学鉴定 菌株NX2A在PDA培养基上的菌落呈圆形，边缘规则，为黑棕色（图1-A）。分生孢子褐色，具有3个颜色较深的隔膜，自基部数至第3个细胞膨大，并使孢子呈弯曲状（图1-B）。通过形态学初步鉴定菌株NX2A为弯孢属（Curvularia sp.）。
2. 1. 2 分子生物学鉴定 利用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测（图2），测序获得605 bp的片段（GenBank登录号为OK085709），通过构建系统发育进化树发现，菌株NX2A序列与C. lunata strain D25B和C. lunata strain 6-4F聚在一支，支持率为89%，遗传距离最近（图3）。结合形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将菌株NX2A鉴定为新月弯孢菌（C. lunata）。
2. 2 菌株NX2A对农作物的安全性评估
将浓度为5×106个/mL的菌株NX2A孢子悬浮液喷施于2叶期稗草，接种3 d后，稗草叶片上产生黑色病斑，圆形或不规则形，病斑逐渐增多并相互汇合成不规则形的大黄褐色病斑（图4-A）;接种10 d后，稗草叶片1/3以上甚至全部烂死，叶片发病程度2级或3级，甚至4级，且稗草的生长受到明显抑制（图4-B）。
将浓度为5×106个/mL的菌株NX2A孢子悬浮液喷施于2叶期作物，10 d后，水稻、油菜、番茄、辣椒和茄植株上未见与稗草相同或类似的病斑，病情指数为0，且对作物植株的后续生长无不良影响（图5-A～图5-E）。表明菌株NX2A对水稻、油菜、番茄、辣椒和茄5种常见作物安全，对稗草具有强致病性。
2. 3 菌株NX2A对稗草的致病条件
经菌株NX2A孢子悬浮液喷施处理后，稗草生物量、株高均受到明显抑制，表现出不同程度的致病性（表2）。病情指数介于17.69%～86.51%，鲜重抑制率介于-2.15%～69.64%，其中，在浓度为5.0×106个/mL的孢子悬浮液喷施于1叶期稗草，12 h光照、85%湿度保湿条件下，菌株NX2A对稗草的病情指数和鲜重抑制率最高，分别为86.51%和69.64%。
从表3可看出，各因素对菌株NX2A在稗草上的病情指数影响顺序为：光照时间（C）>孢子浓度（D）>湿度（A）>稗草叶龄（B），且增加湿度有利于菌株NX2A对稗草的侵染;各因素影响菌株NX2A对稗草鲜重抑制率的顺序为孢子浓度（D）>光照时间（C）>湿度（A）>稗草叶龄（B），且增加湿度可提高菌株NX2A对稗草鲜重的抑制效果，菌株NX2A对1叶期稗草的鲜重抑制效果最佳。
从表4分析结果可知，湿度、光照时间和孢子浓度对病情指数有极显著影响（P<0.01），稗草叶龄对病情指数影响不显著（P>0.05），以菌株NX2A对稗草的侵染为目标，可将致病条件确定为A3B2C3D2，即以浓度为5.0×106个/mL的孢子悬浮液喷施于2叶期稗草，12 h光照、85%湿度保湿;湿度、稗草叶龄、光照时间和孢子浓度对稗草鲜重抑制率有极显著影响，以菌株NX2A对稗草鲜重的防控（鲜重抑制率）为目标，可将致病条件确定为A3B1C3D2，即以浓度为5.0×106个/mL的孢子悬浮液喷施于1叶期稗草，12 h光照、85%湿度保湿。
3 讨論
自然界中的植物致病微生物是微生物除草剂的重要来源，新月弯孢菌是被发掘利用较多的一类植物病原真菌，但部分新月弯孢菌也会对作物产生不利影响。据文献报道，南方地区主要水田作物水稻和蔬菜作物辣椒等均能被新月弯孢菌侵染，导致作物的产量和品质下降（费丹等，2014;斐月令等，2021）。刘麟等（2021）从北方向日葵上分离出一株致病的新月弯孢菌;郑金龙等（2021）鉴定出钝叶草叶斑病的病原菌为新月弯孢菌;AbdElfatah等（2021）发现一株新月弯孢菌是埃及番茄早疫病的新病原菌。因此，评估菌株对作物的安全性，是菌株制成生物除草剂的首要前提。检测菌株对作物的安全性，一般是将菌株孢子悬浮液喷雾接种于作物幼苗植株上，若作物植株上未出现与目标杂草一致或类似病斑，且作物植株生长状态良好，则说明菌株对该作物安全。本研究通过选择主要水田及其周围主要旱地作物进行安全性评价，将菌株NX2A分生孢子悬浮液喷施于2叶期水稻、油菜、辣椒、茄和番茄5种作物后，均未出现与稗草相同或类似的病斑，作物生长状态良好。研究表明新月弯孢菌的致病性与其遗传背景具有相关性（张欣芳等，2010），不同遗传背景的新月弯孢菌具有不同的致病力及寄主范围。因此，由感病稗草叶片上分离获得的菌株NX2A具有对水稻安全、对稗草具有强致病性的可能性。Li等（2013）从感病稗草上分离获得的新月弯孢菌B6对水稻安全，且对稗草具有强致病性。陆俞萍等（2021）自茶园感病杂草上分离得到的新月弯孢菌菌株ZJJMT-1-7为茶园杂草的病原菌。张亚鑫等（2021）从感病稗草上分离得到的新月弯孢菌菌株JSLS-3-4为田间稗草的病原菌。综合菌株NX2A的遗传背景及作物安全性试验，初步表明施用菌株NX2A的区域农作物可安全生长。
确定生防菌对目标杂草具有良好的防治效果，明确各因素对生防菌防效的影响，是开发生物除草剂的重要前提（李永龙，2013）。本研究以稗草的病情指数和鲜重抑制率为考察指标，以湿度、稗草叶龄、光照时间和孢子浓度为考察因素，进行菌株NX2A致病条件试验，结果表明，菌株NX2A对稗草的最佳防效组合为：孢子浓度5.0×106个/mL，1叶期稗草，12 h光照，85%湿度保湿培养，在该条件下，稗草的病情指数可达86.51%、鲜重抑制率可达69.64%。
正交试验是基于数理统计原理，综合多因素，寻找主要影响因子以及最优水平组合的试验设计方法，具有高效、方便、全面的特点（陈小桦等，2012;王玄静，2016）。一般从以下几个方面进行分析：（1）R值越大，对考察指标的影响越大;（2）K值最大的为最佳水平;（3）P值小于0.05，因子对指标具有显著影响;（4）综合各因子的最佳水平以及对考察指标具有显著影响，初步获得试验的理论最优水平组合。与新月弯孢菌菌株J15（2）（韦韬等，2011）和B6（Li et al.，2013）的防效与稗草叶龄呈负相关不同，菌株NX2A在1～3叶期稗草的病情指数无显著差异，表明菌株NX2A对稗草的致病周期更长、更有利于施用。较不够全面的单因子法而言，本研究采用的正交试验更为全面，在确定菌株NX2A对稗草防效的显著影响因子时，可获得菌株NX2A对稗草防效的主要影响因子以及理论最优组合。
4 结论
新月弯孢菌菌株NX2A对稗草有较好的防控效果，且对水稻、油菜、辣椒、茄和番茄等作物安全，具有作为水田稗草生物防控菌剂的潜力。影响菌株NX2A侵染稗草幼苗的主要因素是孢子浓度和光照时间，应着重考虑这2个因素对菌株NX2A防控稗草效果的影响。
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（责任编辑 麻小燕）
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