甜瓜再生体系的建立
祁宏英 徐洪国 王秀文 王芳 尹帮果 高美玲
摘 要：以葫芦科的甜瓜为试验对象，探讨不同基因型、不同激素浓度配比及抗生素胁迫对其不定芽萌发的影响，以期建立甜瓜再生培养体系，为甜瓜遗传转化奠定基础。结果表明，甜瓜在初代培养时，不定芽发生的培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA，甜瓜再生率最高，达到92.5%;甜瓜在继代培养中，0.3 mg·L-1 6-BA的处理最适宜不定芽的伸长生长，0.7 mg·L-1 6-BA的处理甜瓜不定芽增殖系数最高达到2.33;当Kan（卡那霉素）质量浓度大于 20 mg·L-1 时，外植体基本全部褐化，无法分化出绿芽。Amp（氨苄青霉素）在一定质量浓度下对不定芽发生的影响差异性不显著。
关键词：甜瓜;不定芽;再生;抗生素
中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）05-105-04
Optimization of regeneration system of melon
QI Hongying1，2， XU Hongguo1，2， WANG Xiuwen1， WANG Fang1，2， YIN Bangguo1， GAO Meiling1，2
（1.College of Life Science and Agriculture Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China; 2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）
Abstract：
In this experiment， the effects of different hormone combinations on the regeneration system of different genotypes of melon were studied，and the effects of different hormone combinations and genotypes on the regeneration of melon lines were studied， and the effects of antibiotics on the tolerance of adventitious buds of melon were explored. The aim was to optimize the regeneration culture system of muskmelon and lay the foundation for genetic transformation of melon. The results showed that when the medium of adventitious bud was MS+1.0 mg·L-1 6-BA， the regeneration rate of muskmelon was the highest up to 92.5%. The concentration of 0.3 mg·L-1 6-BA in muskmelon was the most suitable for the growth of adventitious buds. Under the concentration of 0.7 mg·L-1 6-BA， the highest multiplication coefficient of adventitious buds was 2.33. When the concentration of Kan was higher than 20 mg·L-1， the explant was browning and could not differentiate into green buds. There was no significant difference in the effect of certain concentration of Amp on adventitious bud formation.
Key words：
Melon; Adventitious buds; Regeneration; Antibiotics
甜瓜（Cucumis melo）是全國乃至全球普遍种植的一种经济作物，果实口感佳、营养丰富、品味独特，是一种广受人们喜爱的食用果品[1]。大多数研究表明，植物的基因型是其器官发生的主要影响因素。随着植物基因工程的发展，通过转基因技术改良甜瓜品质成为新的研究热点，这为提高甜瓜品质和抗逆性开辟了更加安全可靠、快捷可行的途径[2-3]。建立甜瓜高效再生体系是遗传转化的基础，基因型不同，其再生能力也会受到很大的影响，种间、品种之间的再生能力、再生频率差异显著[4-6]。在农杆菌介导的培养转化过程中，一个很重要的环节是抑制农杆菌的生长，防止农杆菌过度增殖对植物组织细胞造成伤害和影响植株的再生，这就需要用抗生素及时有效地抑制，要求使用的抗生素在不伤害或少伤害受体材料的同时能完全抑制农杆菌的生长[7]。笔者以葫芦科的甜瓜为试验对象，研究不同基因型、不同激素浓度配比及抗生素胁迫对其不定芽萌发的影响，探究其变化规律，优化甜瓜的再生体系，为利用生物技术培育具有抗病虫害、抗逆性等优良农艺性状的甜瓜及其他农作物品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试甜瓜材料T3、T4、T8、T18、T35、82ck、81×83均由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院西甜瓜课题组提供。试验于2018年4—6月在齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物组织培养实验室进行。
1.2 方法
1.2.1 种子消毒 挑选大小均一、籽粒饱满的种子于清水中浸泡6～8 h，种子去壳;在75%的乙醇中振荡30 s倒出乙醇，用无菌水清洗2次，倒入0.1%氯化汞浸没种子，均匀晃动5～8 min;倒出氯化汞，再使用无菌水清洗 4～6次，每次约30 s;倒出里面的无菌水，种子表面的水分用无菌滤纸吸干。
1.2.2 甜瓜无菌苗培养 参照孔维萍等[8]的方法，将消毒的甜瓜种子在无菌环境下接入1/2 MS培养基中，平置，每瓶5 粒种子;暗培养2 d后转入25 ℃、1600 lx光照16 h/黑暗8 h条件下，培养3 d，统计成活率。
1.2.3 甜瓜不定芽的诱导 将生长5 d左右的甜瓜81×83无菌苗子叶外植体接种于MS培养基上， 该培养基附加不同浓度的6-BA、NAA。在光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h、温度25 ℃条件下培养。21 d后统计甜瓜外植体的出愈率和出芽率。
1.2.4 甜瓜不定芽的伸长及继代增殖培养 将甜瓜81×83不定芽诱导中获得的有效芽接入不同质量浓度6-BA（0～0.7 mg·L-1）的培养基中进行不定芽伸长及继代增殖培养实验，培养环境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，温度 25 ℃。培养20 d后，观察并统计不定芽伸长及增殖情况。
1.2.5 甜瓜不定芽生根 基本培养基为1/2 MS培养基。挑选长度为3～5 cm的甜瓜81×83无根苗，用手术刀切除底部多余的愈伤组织，将无根苗接入分别添加不同浓度 NAA的1/2 MS培养基中。每个处理接种10瓶，每瓶接4株无根苗。培养环境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，温度25 ℃，观察生根情况。
1.2.6 不同基因型甜瓜子叶节不定芽发生情况 将7种不同基因型的甜瓜种子，按照前述方法进行无菌苗培育，切取子叶节外植体，在MS+6-BA 1.0 mg·L-1培养基中进行不定芽诱导。
1.2.7 抗生素对甜瓜不定芽耐受性的影响 配制前期所得的不定芽最佳培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1培养基，加完琼脂煮沸后用量筒量取40 mL，倒入锥形瓶中，将瓶口封好放入121 ℃、20 min下高压灭菌。将抗生素过滤灭菌后分别添加0、5、10、15、20、30 mg·L-1卡那霉素（Kan），0、50、100、150、200、300 mg·L-1氨苄青霉素（Amp）。选择再生无菌苗叶片1.0 cm2叶盘接入培养基中，每个处理接种10瓶，每个瓶接4个外植体，接种完后，封口，放入光照培养室中进行恒温光照培养。培养环境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，温度25 ℃。21 d后统计子叶不定芽发生情况。
1.3 统计与分析
成苗率/%=成苗数/接种数×100;再生频率/%=发生不定芽的外植体数/供试外植体总数×100;增殖系数/%=（新增芽数+伸长芽数）/供试再生芽数×100;生根率/%=生根外植体数/供试外植体总数×100。
借助SPSS 19.0 统计软件，采用Duncan多重比较法进行数据处理分析。
2 结果与分析
2.1 甜瓜无菌苗萌发
从表1可以看出，甜瓜种子的发芽率也因基因型的不同而出现较大的差异，成苗率为10%～93%，T35、82ck基因型的甜瓜种子发芽率均达到90%及以上，而T8基因型的甜瓜种子成苗率只有10%。出现此现象可能是由于种子状态不佳，此基因型的种子壳大，易破，且种仁极软，在去壳过程中遭到一定程度的破坏。
2.2 甜瓜不定芽发生
2.2.1 不同激素组合对甜瓜不定芽发生的影响 从表2中可以看出，在1.0 mg·L-1 6-BA培养基条件下，甜瓜不定芽再生频率最高，达到92.5%;而分布在此质量浓度左右的，质量浓度较低的不定芽发生不明显，而质量浓度较高的会有一定的抑制作用，6-BA 0.5 mg·L-1的不定芽再生频率较低，只有37.5%，具有较大的差异性，随着质量浓度的增加，不定芽的再生频率降低，2.0 mg·L-1 6-BA不定芽再生频率只有32.5%，低于0.5 mg·L-1 6-BA的再生頻率，说明6-BA对于不定芽的再生频率随着激素质量浓度的升高而升高，但到一定质量浓度后，再生频率开始下降，有一定的抑制作用。在添加NAA 0.1 mg·L-1的4个处理中，不定芽再生频率也在1.0 mg·L-1 6-BA时达到最高，为67.5%。从表2数据可以看出，在同等6-BA质量浓度、添加NAA激素培养条件下，不定芽的出芽率明显低于不添加NAA的培养基，并且在培养后期，少量添加NAA的培养基已生根。
2.2.2 不同甜瓜材料不定芽发生情况 从表3可以看出，T35的不定芽再生频率最高，达到87.5%;T4的次之，为71.87%;T3的再生频率为59.37%，居于第三;T18、81×83、82ck、的相对较低，分别为53.12%、50.00%和37.50%;T8的再生频率最低，只有10.00%。7个甜瓜材料子叶外植体不定芽的发生出现了极性，大部分不定芽是发生在近轴切口处，而远轴切口处不定芽发生数较少。T35和T18材料的外植体在接种后，出现近轴端伤口变得较为宽阔，从而发生了数目极多的不定芽。
2.3 不定芽的伸长及增殖培养
甜瓜不定芽的最适宜伸长培养基为MS+6-BA 0.3 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%琼脂（表4）。在这种激素质量浓度下，不定芽生长的速度最快，且没有出现玻璃化现象，经15 d就可以获得3～5 cm高且健壮的试管苗;当激素质量浓度逐渐升高时，发现新增不定芽数也逐渐增加，MS+6-BA0.7 mg·L-1条件外植体增殖系数最高，为2.33，这一结果与前期不定芽诱导结果相似， 6-BA质量浓度越接近1.0 mg·L-1，不定芽发生越多。
2.4 生根培养
无根苗的生根情况，从表5可以看出，对照的生根率最高，达到90%，当NAA激素质量浓度逐渐升高时，无根苗的生根率逐渐下降，高质量浓度的NAA对根的发生有一定的抑制作用。此试验得出，无激素添加的培养基，生根率最高。
2.5 抗生素对甜瓜不定芽耐受性的影响
2.5.1 卡那霉素对甜瓜不定芽耐受性的影响 从4种质量浓度梯度Kan+MS+1.0 mg·L-1 6-BA的培养结果（表6）可以看出，甜瓜子叶愈伤组织形成受到了不同程度的影响，不定芽同样受到了抑制;但是，添加了抗生素的培养基基本无污染，较好地抑制了菌的生长。随着Kan质量浓度的增加，不定芽的发生数呈下降趋势，当Kan的质量浓度达到20 mg·L-1时，外植体都发生大量的愈伤组织，但是发生不定芽的外植体很少，且不定芽数也极少;当Kan的质量浓度达到30 mg·L-1时，再生频率为0。而5 mg·L-1的Kan与对照相比，再生频率相对较高，由于对照中未添加抗生素，所以有一部分发生污染，少量的抗生素有效地抑制了菌的产生，间接提高了不定芽的再生频率。
2.5.2 氨苄青霉素对甜瓜不定芽耐受性的影响 氨苄青霉素（Amp）对甜瓜不定芽再生的抑制作用不是很明显，从表7可以得知，前4种Amp质量浓度的培养基中，无明显抑制现象，当氨苄青霉素质量浓度为100 mg·L-1时，不定芽再生率最高，达到90.00%。当外植体处于0、50、100、150、200 mg·L-1 Amp条件下培养时，其再生能力并没有较大程度的差异，当抗生素质量浓度上升到300 mg·L-1时，外植体不定芽再生频率明显降低，但再生频率仍然能够达到50%，因此，进行遗传转化时可以使用氨苄青霉素作为农杆菌生长的抑制剂。
3 讨论与结论
由本文的结果可知，在芽诱导阶段，甜瓜子叶外植体在不同激素质量浓度配比的MS培养基上可诱导出不定芽丛或愈伤组织。培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA时，再生率能达到92.5%，高质量浓度的6-BA诱导易出现丛芽，这与孙天国的试验结果一致[9]。另外，子叶芽诱导时出现极性现象，即不定芽总是出现在子叶近轴端。对此也有许多国内外学者进行了研究和报道[10-11]。在芽伸长培养基的选择上，笔者采用了低质量浓度的6-BA，发现将丛生芽转接到含有0.3 mg·L-1 6-BA的改良分化培养基上伸长效果最好，这与张慧君[12]的实验结果相似。在利用农杆菌介导的遗传转化过程中，在选择培养阶段由于抑制农杆菌的生长而加入的抑菌素在一定程度上也会影响芽的分化和生长。在试验中发现，在不定芽诱导过程中，加入少量的抗生素可抑制菌的产生，试验结果显示100 mg·L-1的氨苄青霉素可以抑制菌的生长，一定程度促进了不定芽的分化，质量浓度升高至300 mg·L-1时，对不定芽的分化有一定的抑制作用，再生頻率显著下降，因此，进行遗传转化时可以使用氨苄青霉素作为农杆菌生长的抑制剂。
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